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序贯靶向酶引导的自组装超分子纳米纤维减轻椎间盘退变

BCML速递 · 公众号 · · 2024-11-07 22:00

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椎间盘退变（ IVDD ）引起的腰痛（ LBP ）是一个全球性的公共卫生问题，慢性炎症和衰老过程对其发病和进展有重要影响。在 IVDD 的病理环境下，椎间盘细胞和外源性免疫细胞会分泌大量促炎细胞因子，从而触发炎症级联反应，激活基质金属蛋白酶，促进分解代谢，加速退变过程。此外，长期的炎症刺激加速内在细胞的过早老化，从而通过衰老相关分泌表型（ SASP ）与促炎细胞因子协同作用，促进疾病发展。因此，阻断这种协同作用可以减少炎症和衰老引起的椎间盘细胞外基质损伤。

为此，来自山东大学的 Liu Xinyu 、天津师范大学的 Shang Yuna 、 Li Chunju 和天津大学 Yang Qiang 教授及其团队合作构建了一系列自组装的超分子肽（ Fbp-GFFYPLGLAG （ E ） nRGD ， n = 4 ， 2 ， 0 ），其模块化分子设计主要包括以下几个部分： i ）氟比洛芬（ Fbp ）选择性地结合 COX-2 并阻碍炎症级联和 SASP 的活化； ii ） PLGLAG 作为 MMP-2 应答肽； iii ） GFFY 用作自组装基序； iv ）（ E ） n 用于肽的亲水性修饰； v ） RGD 作为细胞亲和肽，促进未被 MMP-2 切割的超分子肽进入细胞。

在椎间盘退变的微环境中，肽前体与两个不同空间（细胞内和细胞间）中过度表达的 MMP-2 产生反应，从而形成原位自组装纳米纤维。负载氟比洛芬的纳米纤维可在 MMP-2 丰富的区域被富集并保留较长时间，还可在时间维度上按需释放。随后，摄入细胞内的氟比洛芬纳米纤维与髓核细胞或巨噬细胞内的 COX-2 特异性结合，在减轻炎症级联反应和 SASP 方面实现协同效应，从而延缓椎间盘退变的进展（ scheme 1 ）。

为了验证超分子肽的功能，研究者首先设计了一系列肽前体（ Comp. 1-3 ， Fbp-GFFYPLGLAG （ E ） nRGD ， n = 4 ， 2 ， 0 ；图 1A ）。实验发现，含有不同数量的亲水性氨基酸的溶解度不同，含有更多谷氨酸的 Comp.1 （ Fbp-GFFYPLGLAG （ E ） nRGD ， n = 4 ）比 Comp.2 （ Fbp-GFFYPLGLAG （ E ） nRGD ， n = 2 ）和 Comp.3 （ Fbp-GFFYPLGLAG （ E ） nRGD ， n = 0 ）有更好的溶解度（图 1B ）。此外， Comp.1 的纳米结构不规则，在加热和冷却后形成大量聚集体，并且在添加 MMP-2 之后， Comp.1 自组装成直径为约 11 nm 的纳米纤维。相比之下， Comp.2 在加热和冷却后发生明显的形态变化，并且在添加 MMP-2 之后变为短棒状纳米纤维（图 1C 、 D ）。与此同时， Comp.1 （命名为 Fbp-GFFYPLGLAGEEERGD ）表现出对 MMP-2 介导降解的敏感性（图 1 E 、 F ）。

此外，研究者检测了不同浓度的 Comp.1-2 的生物相容性，结果发现，在 500 μM 浓度下， Comp.1-2 的细胞增殖活性显著降低， 250 μM 是后续研究中安全干预的适当阈值（图 2A-E ）。

为进一步为了验证两种化合物可以被细胞摄取，研究者合成了用 NBD 荧光团替代 Fbp 的 Comp.4 （ NBD-GFFYPLGLAG （ E ） nRGD ， n = 4 ）和 Comp.5 （ NBD-GFFYPLGLAG （ E ） nRGD ， n = 2 ）用于可视化。随后的细胞摄取实验揭示 Comp.4-5 可以聚集在细胞核（蓝色）周围，并且随着时间的延长，绿色荧光显著增加（图 2F ， G ）。此外， Comp.1 -2 被细胞摄取后呈纳米纤维形式（黄色箭头），分散在经处理的 NPC 的整个细胞质中，并且当纳米纤维被溶酶体吞噬和降解时，也形成存在于细胞质内的纳米颗粒（蓝色箭头）（图 2 H ， I ）。

另外，研究者证明了 Comp.1-2 具有在体外阻断炎症级联反应并抑制巨噬细胞 M1 极化的功能。首先，与 TNF- α组相比， Comp.1 显著增加了 NPC 中 COL-2 表达，同时降低炎性蛋白 iNOS 、 COX-2 和 MMP-2 表达的能力。而 Comp.2 表现出与 Comp.1 类似的减弱特定炎性因子的作用，但它并不能纠正 COL-2 表达水平的降低（图 3A-C ）。其次，在进一步研究对巨噬细胞极化的影响后，研究者发现， Fbp 、 Comp.1 和 Comp.2 均显示出抑制 LPS 诱导的 M1 巨噬细胞极化的能力。其中， Comp.1 发挥最有效的抑制作用（图 3D ， E ）。上述结果进一步验证了， Comp.1 通过减少炎性基因和蛋白质的表达，抑制 M1 巨噬细胞的极化，同时促进合成代谢标志物如 COL-2 和聚集蛋白聚糖的表达，发挥显著的抗炎作用。

Comp.1 还可减少体外老化 NPC 中的 DNA 损伤、抑制 SASP 表达和细胞周期阻滞。具体而言，与过早衰老的 NPC 相比， Comp.1 有效抑制 DNA 损伤标记物 𝛾 H2AX 的表达并减轻 COL-2 分泌的减少（图 4A 、 E 、 F ）。并且，在 Comp.1 干预后， β- 半乳糖苷酶（ SA-β-GAL ）阳性细胞的比例显著低于 TNF-α 组（图 4B ， G ）。与此同时，作为 DNA 复制的可靠指标的 EdU 在 Comp.1 处理后显著上调。这表明， Comp.1 恢复了老化 NPC 的 DNA 复制能力（图 4C 、 H ）。此外， Fbp 、 Comp.1 和 Comp.2 处理促进了衰老 NPC 从 G1 期向 G2 期的转变，最终导致 G2 期细胞比例增加（图 4D ， I ）。

研究者进一步探索了延缓炎症诱导 NPC 细胞衰老的分子机制。火山图结果证明，不同组之间有多个具有显著表达变化的基因（图 5A ， B ）。其中， TNF-α 组中的差异表达基因（ DEG ）主要与粘着斑、 ECM- 受体相互作用、 TNF 信号传导途径、吞噬体、肌动蛋白细胞骨架的调节和趋化因子信号传导途径的途径相关（图 5C ）；而 Comp.1 组的 DEG 主要与诸如 DNA 复制、 ECM- 受体相互作用、细胞周期、粘着斑、细胞衰老和 PI3K-Akt 信号传导途径等相关（图 5D ）。基于相关的调控途径，研究者筛选了热图中的主要差异表达蛋白，发现，整合素 β2 、整合素 β3 、整合素 β10 、 CCNA 和整合素 β4 是较为接近的五种蛋白质（图 5E-I ）。

最后，研究者体内验证了 Comp.1 可延迟体内椎间盘高度（图 6 A-E ）和髓核含水量（图 6 F-J ）的降低，并通过抑制 M1 巨噬细胞极化和衰老细胞聚集延缓髓核基质降解和纤维化过程（图 8 ）。首先研究者通过染色探讨了不同组间椎间盘结构和细胞外基质的恢复情况（图 7 ）。为了进一步研究 Comp1 对炎症反应和衰老细胞原位聚集的抑制作用，研究者在椎间盘病理切片上进行了 M1 巨噬细胞表型标记（ CD86/F4/80 ）和衰老细胞标记 SA- 𝛽 -Gal 的免疫荧光染色。与体外结果一致，体内结果表明， Comp1 抑制了 M1 巨噬细胞标志 CD86 和 F4/80 的表达，并减弱了衰老细胞标志 SA- 𝛽 -gal 的表达（图 8 ）。

综上所述，本研究介绍了一种很有前景的策略，即利用酶介导的载药纳米纤维自组装来破坏炎症和细胞衰老的联合作用。在退变椎间盘中， MMP-2 的过度表达触发了纳米纤维，导致原位自组装成竞争性抑制 COX-2 的结构。这种抑制作用可抑制炎症并减少 M1 巨噬细胞极化。这些纳米纤维可能通过 DNA 损伤信号传导途径来减轻衰老 NPC 中的 SASP 和 DNA 损伤。氟比洛芬纳米纤维可有效地阻止衰老的 NPC 和 M1 巨噬细胞的聚集，从而延缓了 IVDD 的进展。该方法为 IVDD 的治疗提供了新的方向。

本研究由来自来自山东大学的 Liu Xinyu 、天津师范大学的 Shang Yuna 、 Li Chunju 和天津大学 Yang Qiang 教授及其团队完成，并与 2024 年 9 月 2 日在线发表于 Advanced Materials 。

文献信息： Yang Liu, Xun Sun, Lianlei Wang, Yiming Dou, Ye Tian, Tianyu Yu, Yiming Zhang, Qingqian Zhao, Jiayi Lu, Yinyin Feng, Jiayu Wang, Xinyu Liu*, Yuna Shang*, Chunju Li*, and Qiang Yang*. Sequential Targeted Enzyme-Instructed Self-Assembly Supramolecular Nanofibers to Attenuate Intervertebral Disc Degeneration. Advanced Materials 2024: 2408678.

供稿：许梦平

审校：孙亨

编辑：陆凯