摘
要：
目的
运用网络药理学的方法，以《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》第
7
版中的轻型（湿热蕴肺证）、普通型（湿毒郁肺证）、重型（气营两燔证）、危重型（内闭外脱证）和恢复期（气阴两虚证）
5
个证型及其对应复方为研究对象，分析探讨中医分期治疗新型冠状病毒肺炎（
corona virus disease 2019
，
COVID-19
）过程中各证候及其所用复方的作用机制。
方法
通过检索
中药系统药理学数据库和分析平台（
TCMSP
）等数据库和文献获取
5
个证型对应的复方的活性成分及其靶点，使用
Geen Card
等数据库检索
5
个证型临床表现的靶点，基于
5
个证型及其对应复方的活性成分的交集靶点建立蛋白互作（
p
rotein-proteininteractions
，
PPI
）网络，并进行京都基因与基因组百科全书（
Kyoto encyclopedia of genes and genomes
，
KEGG
）富集分析。
结果
湿热蕴肺证、湿毒郁肺证、气营两燔证、内闭外脱证和气阴两虚证与其对应复方的活性成分的交集靶点数目分别是
252
、
322
、
402
、
140
和
399
，交集靶点主要包括
VEGFA
、
EGFR
、
CASP3
、
AKT1
等。
5
个证型对应复方干预的通路类型大体相似，但各复方干预通路的侧重点不同，湿热蕴肺证和湿毒郁肺证对应复方侧重于干扰病毒和增强机体的免疫应答；气营两燔证和内闭外脱证对应复方着重缓解神经系统的异常，以恢复机体神志；气阴两虚证对应复方进一步参与细胞生长过程和增强机体免疫功能，以扶助机体正气。
结论
5
个证型对应复方以多成分、多靶点和多途径的方式，主要通过抗病毒、抑制炎症反应、增强免疫应答和保护主要靶器官来治疗
COVID-19
，这说明了中医辨证论治和方证对应的治疗特点，解释了中医分期治疗
COVID-19
的合理性。
新型冠状病毒肺炎（
corona virus disease 2019
，
COVID-19
）爆发以来，引起了全球各界的关注。
2020
年
2
月
11
日国际病毒分类委员会（
ICTV
）宣布，将新型冠状病毒正式命名为严重急性呼吸综合征冠状病毒
2
（
severe acute respiratorysyndrome coronavirus 2
，
SARS-CoV-2
）。在治疗
COVID-19
的过程中，中医药的参与度极高，且获得了确切的疗效，
COVID-19
在中医上属于“疫”的范畴，病位在肺，中医认为
COVID-19
患者主要由外邪入侵（
SARS-CoV-2
感染）和正气不足（人体免疫力下降）引发，后期由于机体和脏腑功能失调使得疾病进一步加重
[1]
。中医强调“扶正”和“祛邪”，注重整体观和三因制宜，在疫情的防控中发挥着积极的作用。
COVID-19
的病情变化具有明显的阶段性，且病情轻重在临床诊疗中易于识别，因此分期论治具有合理性和必要性
[2]
。在国家卫生健康委员会发布的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》第
7
版
[3]
中，中医采取了分期治疗的方式，将疾病的临床治疗期分为轻型、普通型、重型、危重型和恢复期
5
个阶段。
中医以整体观念和辨证论治为治疗原则，其中“证”是中医特有的概念和核心内容，能够反映疾病发生过程中某一阶段病理变化的本质，患者感染
SARS-CoV-2
后会因为自身体质、地区和疾病阶段而表现为不同的证型，因此利用现代医学和生命科学等技术和方法，从新的视角深入阐释中医证候的形成原
因对中医药现代化具有重要意义
[4]
。张伯礼院士团队
[5]
结合全国各地病例和治疗方案，发现
COVID-19
的病因多归为“湿或湿热之邪”，认为此病当为“湿毒疫”，并将核心病机归纳为“寒、湿、热、毒、瘀、闭、虚”。基于此，本研究选择了《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》第
7
版
[3]
中的湿热蕴肺证（轻型）、湿毒郁肺证（普通型）、气营两燔证（重型）、内闭外脱证（危重型）和气阴两虚证（恢复期）
5
个证型及其对应复方为研究对象，使用网络药理学的方法，对
5
个证型的证候表现及其所用复方的靶点和通路进行预测和挖掘，以期阐明各证型的分子作用机制。
1
方法
1.1
5
个证型所用复方的活性成分及其靶点的收集
以湿热蕴肺证（轻型）、湿毒郁肺证（普通型）、气营两燔证（重型）、内闭外脱证（危重型）和气阴两虚证（恢复期）
5
个证型所用复方的中药为研究对象，使用中药系统药理学数据库和分析平台（
TCMSP
，
http://tcmspw.com/tcmsp.php
）、中药综合数据库（
TCMID
，
http://119.3.41.228:8000/tcmid/
）和检索文献获得各中药的主要活性成分，其中
TCMSP
数据库的筛选参数为口服利用度（
oral bioavailability
，
OB
）≥
30%
、
类药性（
drug like index
，
DL
）≥
0.18
。
利用
TCMSP
数据库、
Swiss Target Prediction
数据库（
http://www.swisstargetprediction. ch/
）和
Pharmmapper
数据库（
http://www.lilab- ecust.cn/pharmmapper/
）获得各中药主要活性成分的作用靶点。
1.2
5
个证型临床表现的靶点收集
对湿热蕴肺证（轻型）、湿毒郁肺证（普通型）、气营两燔证（重型）、内闭外脱证（危重型）和气阴两虚证（恢复期）的临床表现进行整理，使用
Geen Card
数据库（
https://www.genecards.org/
）、
TTD
数据库（
http://db.idrblab.net/ttd/
）和
OMIM
数据库（
https://www.omim.org/
）检索各证型临床表现的靶点。
1.3
蛋白互作
（
protein-protein interactions
，
PPI
）
网络的构建
对各复方活性成分的靶点和各证型临床表现的靶点取交集，将各证型的交集靶点上传至
STRING
数据库（
https://string-db.org/
），设置生物物种为人，置信度≥
0.400
，将构建的
PPI
网络信息导入
Cytoscape3.8.0
软件，计算度（
degree
）值，基于
cytoHubba
插件的拓扑算法预测网络中重要的蛋白节点和子网，并进行可视化处理。
血管紧张素转换酶
2
（
angiotensinconverting enzyme 2
，
ACE2
）是
SARS-CoV-2 S
蛋白的受体，介导病毒进入靶细胞。在小鼠急性肺损伤模型中，与野生型小鼠相比，
ACE2
基因敲除小鼠的肺功能显著恶化，而注射外源性重组人
ACE2
可减轻肺损伤程度
[6]
，说明在
SARS-CoV-2
的致病过程中，
ACE2
不仅是病毒进入细胞的受体，也是病毒引发肺损伤的靶分子
[7]
。因此，将
ACE2
蛋白与各复方筛选得到的关键蛋白共同导入
STRING
数据库构建
PPI
网络，查看复方的关键蛋白与
ACE2
蛋白的相互作用。
1.4
京都基因与基因组百科全书
（
Kyoto encyclopedia of genes and genomes
，
KEGG
）
通路富集分析
将交集靶点导入
DAVID
数据库（
https://david.ncifcrf.gov/
），选择生物物种为人，设定阈值为
P
≤
0.05
，将富集结果的前
20
条通路进行可视化处理。
2
结果
2.1
5
个证型所用复方的活性成分和靶点分析
以
OB
≥
30%
、
DL
≥
0.18
为筛选参数，检索
TCMSP
数据库中
COVID-19
的
5
个证型复方的主要活性成分和靶点。对于
TCMSP
数据库中不包含的中药生石膏、水牛角、安宫牛黄丸、麦冬和生地通过
TCMID
数据库检索其主要活性成分，竹叶（淡竹叶）
[8-10]
、化橘红
[11-12]
、地龙
[13]
和焦三仙（焦山楂
[14-15]
、焦神曲
[16-19]
）通过检索文献获得主要活性成分，并使用
Swiss Target Prediction
数据库获得其靶点蛋白。生石膏所含成分使用
Pharmmapper
数据库获得其作用靶点。
忽略炮制方式，
5
个证型复方所含中药的主要活性成分及其作用靶点见表
1
。
其中，湿热蕴肺证（轻型）复方包含
12
种中药，检索到
188
个活性成分及
260
个靶点；湿毒郁肺证（普通型）复方包含
13
种中药，检索到
162
个活性成分及
340
个靶点；气营两燔证（重型）复方包含
12
种中药，检索到
194
个活性成分及
437
个靶点；内闭外脱证（危重型）复方包含
4
种中药，检索到
46
个活性成分及
163
个靶点；气阴两虚证（恢复期）复方包含
10
种中药，检索到
253
个活性成分及
431
个靶点。
2.2
5
个证型临床表现的靶点
将
COVID-19
的
5
个证型的临床表现及其对应检索词进行整合，利用
Geen Card
、
TTD
和
OMIM
数据库检索各证型临床表现的靶点，见表
2
。
2.3
5
个证型及其对应复方的交集靶点
对
COVID-19
的
5
个证型的临床表现及其复方的靶点取交集，如图
1
所示，
5
个证型及其对应复方的交集靶点数目分别是
252
、
322
、
402
、
140
、
399
，结果表明
5
个证型复方对
COVID-19
相关证型具有调控作用。
2.4 PPI
蛋白互作网络和
KEGG
通路分析
将交集靶点上传至
SRTRING
数据库得到的
PPI
网络导入
Cytoscape3.8.0
软件，通过
CytoHubba
插件以度为条件进行拓扑分析，分别筛选出排名前
10
的关键蛋白，获得的关键蛋白如图
2
所示，颜色由红至黄代表度值从大到小。其中，
5
个证型复方的关键蛋白都包括血管内皮生长因子
A
（
vascular endothelial growth factor A
，
VEGFA
）、表皮生长因子受体（
epidermal growth factor receptor
，
EGFR
）、
胱天蛋白酶
3
（
caspase-3
，
CASP3
）、蛋白激酶
B1
（
proteinkinase B1
，
PKB1
或
AKT1
），说明这
4
个靶点在治疗
COVID-19
的过程中具有重要作用。将
5
个证型复方的关键蛋白与
ACE2
蛋白共同导入
STRING
数据库后得到的
PPI
网络如图
3
所示，表明
5
个证型复方的关键蛋白与
ACE2
蛋白关系密切，其中丝裂原激活蛋白激酶
8
（
mitogen-activatedprotein kinase 8
，
MAPK8
）、白细胞介素
-6
（
IL-6
）和血清白蛋白（
albumin
，
ALB
）对
ACE2
蛋白有直接作用。
基于
DAVID
数据库分别对
5
个证型复方的交集靶点进行
KEGG
富集分析，通过
Cytoscape 3.8.0
软件将
P
（≤
0.05
）值排名前
20
的通路与复方的
PPI
网络整合，得到
5
个复方的
PPI
网络
-
通路图，如图
2
所示，其中紫色矩形代表交集靶点，红色矩形代表通路。
分别将
COVID-19
的
5
个证型复方排名靠前的通路及其
P
值以热图的形式进行整合，见图
4
。其中
P
值由小到大对应颜色由红色过渡至绿色，可以
看出
5
个证型复方干预的通路类型大体相似，但各复方干预通路的侧重点不同，除内闭外脱证型复方外，其他
4
个证型复方都对乙型肝炎（
hepatitisB
）、肿瘤坏死因子信号通路（
tumor necrosis factor signaling pathway
）、缺氧诱导因子
-1
信号通路（
hypoxia inducible factor-l signaling pathway
）、恰加斯病（
Chagas disease
，
American trypanosomiasis
）、非小细胞肺癌（
non-small cell lung cancer
）和
NOD
样受体信号通路（
NOD-like receptor signaling pathway
）等通路干预性较强。
3
讨论
中医药从证候到复方都是在“辨证论治”和“整体观念”的指导下对疾病进行干预，中药及其复方具有多成分、多靶点和多途径的特点，这些特点为中医药研究者带来了挑战，而网络药理学的出现为中医药研究提供了新的思路。网络药理学基于药物和疾病间的相互作用，在体外通过计算机虚拟技术构建了“药物
-
成分
-
靶点
-
通路
-
疾病”的多层次网络，具有整体性和系统性的特点
[20]
，与中医药的指导思想趋于一致，众多研究者将网络药理学应用于中医药，以解释中医药复杂的作用机制。在治疗
COVID-19
方面，中医药工作者从证型出发，根据患者的不同症候给予不同的治疗方案，而应用网络药理学可实现对疾病、证候、中药及其复方作用机制的挖掘，为
COVID-19
的治疗提供借鉴和参考。许海玉课题组
[21]
以“症状”为切入点，通过中药整合药理学网络计算平台
2.0
，对
COVID-19
中
4
个时期的代表证候方剂构建了分子网络，探讨了
4
个时期
COVID-19
的生物学基础及推荐方剂对证治疗的分子机制，对于揭示推荐方剂的作用原理和科学内涵具有重要意义。本研究基于中医“方证对应”的特点，运用网络药理学对
COVID-19
发展过程中
5
个证型的证候表现及其所用复方的靶点和通路进行预测和挖掘，以期阐述中医“对证”和“对症”治疗的优势和特色，解释中医分期治疗的合理性。
本研究基于网络药理学对《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》第
7
版的
5
个证型及其对应复方进行分析探讨，使用数据库分别筛选出
5
个证型临床表现的靶点及其所用复方主要活性成分的靶点，通过
5
个证型的交集靶点构建
PPI
互作网络并获得关键蛋白，其中
5
个证型相关复方的关键蛋白都包括
VEGFA
、
EGFR
、
CASP3
、
AKT1
。其中
VEGFA
是刺激血管生长的主要因子之一，在激活信号通路和诱导内皮细胞增殖和迁移等方面具有重要作用
[22]
，
药效学实验表明
VEGFA
水平的升高很有可能与肺部炎症消退有关
[23]
。
EGFR
是非小细胞肺癌中最常见的驱动因子之一，
EGFR
酪氨酸激酶抑制剂是非小细胞肺癌的重要治疗手段之一
[24]
，并且非小细胞肺癌通路也出现在通路富集结果中，说明
EGFR
靶点和非小细胞肺癌通路与
COVID-19
具有相关性。
CASP3
是一种蛋白酶，与细胞凋亡等生理过程中具有重要意义，杨波等
[25]
研究发现在小鼠感染
SARS- CoV
导致的心脏损伤和肝脏损伤过程中，
CASP3
具有显著调节相关信号通路的作用。
AKT1
