【惟视讲堂】高度近视白内障：是谁偷走了我的抗氧化能力？

研究者通过对2014年12月至2017年11月间，在复旦大学眼耳鼻喉科医院就诊的4650名HMC和8850名核性ACR患者临床资料的对比分析发现：与ACR相比，HMC具有发病年龄小、核混浊程度重、黑核及玻璃体液化发生率高的临床特点（表1）。

表1  ARC和HMC患者临床特点比较

研究者收集了2016年1月至6月期间在本院行白内障手术的133名ARC和155名HMC患者的前囊膜，对晶状体上皮细胞（LECs）进行总抗氧化能力（T-AOC）及丙二醛（MDA，为脂质过氧化的指标）测定。结果显示，HMC组总抗氧化能力降低、MDA浓度增高，即氧化损伤加重（图1）。

图1  HMC的氧化应激指标

为找到HMC晶状体囊膜抗氧化能力下降的原因，研究者采用Sequenom MassARRAY技术，比较了HMC和ARC晶状体囊膜6种抗氧化基因GSTP1, TXNRD2, NRF2,OGG1, TXN和TXNRD1的甲基化水平和表达水平。发现HMC组GSTP1和TXNRD2启动子CpG单位的甲基化水平明显增高（图2）。

图2  6种抗氧化基因的甲基化水平

研究者进一步对上述两个的特定CpG区域，即GSTP1（#21–25）和TXNRD2（#34）进行甲基化水平重复测定，同时测定GSTP1、TXNRD2 mRNA和蛋白水平的表达量。结果显示，HMC组GSTP1（#21–25）和TXNRD2（#34）的甲基化水平升高有显著统计学意义，GSTP1、TXNRD2表达显著降低（图3）。

图3  GSTP1和TXNRD2的甲基化和表达水平

研究者为进一步证实GSTP1和TXNRD2蛋白在LECs的表达部位和表达水平，采用免疫荧光染色对两组样本进行半定量分析。结果显示，GSTP1和TXNRD2蛋白在晶状体囊膜附着的LECs胞浆中表达，且HMC组表达显著低于ARC组（图4）。

图4  GSTP1和TXNRD2在LECs中的免疫荧光染色

以上结果仅证实了GSTP1、TXNRD2在HMC中的表达变化，研究者为证实其对晶体抗氧化能力的影响，分别采用过表达质粒构建及siRNA使培养LECs过表达和低表达GSTP1、TXNRD2后，测定总抗氧化能力（T-AOC）的变化。结果显示，GSTP1、TXNRD2表达上调后，LECs的T-AOC升高，反之则下降（图5）。GSTP1表达变化后T-AOC变化更明显。说明GSTP1、TXNRD2对LECs的抗氧化能力起正向调节作用。

图5  GSTP1、TXNRD2对LECs抗氧化能力的影响

研究者采用荧光素酶报告实验，研究抗氧化基因启动子不同DNA片段甲基化对启动子活性的影响。结果显示，在去除GSTP1、TXNRD2启动子高甲基化DNA片段后，其转录活性显著降低（图6）。

图6  GSTP1、TXNRD2启动子不同DNA片段甲基化对其活性 的影 响

研究者为明确HMC中GSTP1、TXNRD2启动子甲基化水平增高的原因，测定了HMC组样本中三种DNA甲基转移酶（DNA methyl transferase，DNMT）的活性。结果显示，DNMT1在HMC组表达增高，且在培养LECs中加入DNMT1抑制剂（5-Aza）抑制GSTP1、TXNRD2启动子甲基化后，GSTP1、TXNRD2表达水平上调（图7）。

图7  DNMT1在HMC中的表达量及对GSTP1、TXNRD2的影响

上述结果证实了GSTP1、TXNRD2基因启动子甲基化及表达水平对LECs抗氧化能力的影响，但高氧环境究竟会不会影响GSTP1、TXNRD2的甲基化及表达呢？研究者采用H ₂ O ₂ 模拟眼内的高氧环境，H ₂ O ₂ 处理培养LECs0-8天后，结果显示GSTP1（#21–25）和TXNRD2（#34）甲基化水平呈时间依赖性增高（图8 D），而GSTP1和TXNRD2表达水平在0-6天内升高，在第8天时突然下降（图8 E）。这表明，在高氧环境下，GSTP1和TXNRD2的表达水平首先升高发挥抗氧化作用，随着其启动子甲基化程度增高，GSTP1和TXNRD2的表达下降，以致氧化损伤加重。

图8  高氧环境对GSTP1、TXNRD2启动子甲基化和表达的影响