《自然》子刊：机智！MIT大牛妙招将纳米级光学显微镜带入临床，可使病理诊断准确率大幅提升 | 临床大发现

近日，来自MIT生物工程学院的Edward S Boyden教授与陈飞博士，赵永兴博士以及哈佛大学医学院研究人员合作开发了一种非常简单易操作的技术，显微扩张技术，只需使用婴儿尿不湿中的高分子材料，就可以将普通光学显微镜的分辨率提升到70纳米，并且可以广泛应用于临床病理检测。

同时他们还发现，借助显微扩张技术，病理学家极大的提高了对微小病变肾病（MCD）诊断的准确率（从65%增加到了90%），以及经过深度学习后的AI对于早期乳腺癌的诊断的AUC值（从0.71提高到了0.93）（AUC越接近1诊断越完美，越接近0.5诊断越随机）。这一发现发表在近日的《自然生物技术》杂志上（1）。

这一技术有多牛呢？举个例子，2014年诺贝尔化学奖的三位得主的主要贡献就是开发了超分辨荧光显微镜，成功将光学显微镜的分辨率带入纳米级。而相比于超分辨率荧光显微镜，Boyden教授的显微扩增技术操作更加简单，并且更适用于临床病理诊断。

早在2015年的时候，Boyden教授就在《科学》杂志上发表了显微扩张技术的具体方法（2）。利用这一技术，他们成功在普通光学显微镜下观察到了小鼠神经突触的细微结构，并且小鼠脑组织样本在放大后的结构误差仅2%左右。只不过当时的显微扩张技术只适合科学研究，并不适合临床病理使用。随后，Boyden教授便对其进行了一系列的优化。

2016年的时候，Boyden教授先后开发出了对样本组织蛋白质进行免疫荧光标记的标准方法以及适合RNA荧光原位杂交的显微扩张技术（3，4）。而今年4月份Boyden教授更是开发了重复显微扩张技术，允许对样本进行再次扩张（5）。

此次，Boyden教授主要开发了一系列的临床病理标本处理方法以及DNA荧光原位杂交的方法，并首次证明了用显微扩张技术进行临床病理检测的可行性，成功的扩张了乳腺，前列腺，肺，结肠，肝，肾，卵巢，胰腺等多种器官的正常和癌症组织切片。

其实Boyden教授的方法很简单，但是也很容易被忽视。一般来说，要想提高显微镜的分辨率，正常人第一时间想到的肯定是在显微镜或者光源上做文章。而Boyden教授却想到了一种截然不同的思路，他想通过对所观察的样本进行均匀的物理扩张来提高分辨率。

也就是说，在使用显微镜之前，先将样本在空间上放大100倍。这样不仅可以通过样本自身在空间上的的扩张来提高分辨率。同时，当样本扩张之后，样本中大分子物质之间的间隙会被拉开，光的衍射作用就会减弱（光的衍射作用是限制光学显微镜分辨率最主要的原因），从而进一步提高了显微镜的分辨率。

加水后样本随着高分子聚合物扩张

这一技术听起来也许很高大上，其实操作非常简单。首先，由于临床病理组织切片都是经过处理的，例如福尔马林固定石蜡包埋（FFPE），苏木精和伊红染色（H＆E），或者直接冷冻保存。所以，第一步需要利用Boyden教授所设计的一系列处理步骤（expansionmicroscopy.org上有显微扩张技术的所有操作方法），将各种临床病理样本转化为最适宜扩张的状态。

第二步，研究人员将合成婴儿尿不湿中高分子聚合物的单体物质加入样本中，随后引发聚合反应，在样本中蛋白质周围形成大量的高分子聚合物，同时将样本中的蛋白质锚定在高分子聚合物上。第三步，加入适量含蛋白酶K的溶液切断组织细胞以及蛋白质之间连接，以便均匀扩张。最后加水，在蛋白质的推动下，组织细胞会随着高分子材料均匀扩张，同时对目标蛋白质进行免疫荧光标记以便观察（DNA，RNA荧光原位杂交技术也可以使用）。

样本中蛋白质随着高分子材料扩张

随后，为了验证显微扩张技术是否真的有助于临床病理诊断。研究人员选择了两种临床常见的并且具有挑战性的疾病，微小病变肾病（MCD）和早期乳腺癌，来验证其效果。

首先是MCD，长期以来，MCD以及局灶性节段性肾小球硬化症(FSGS)的诊断都需要借助电子显微镜（6）。因为，在MCD患者体内，本应该呈手指装包裹在微血管周围的肾脏足细胞，失去了自己的形态特征，而每个足突的大小在200纳米左右，超过了传统光学显微镜的分辨率极限，只能在电子显微镜下观看。

高大上的电子显微镜

而当研究人员按显微扩张技术的标准制作了正常人体肾脏组织切片后，他们成功的在光学显微镜下看到了足细胞的突起。同时，研究人员还对比了正常人体肾脏切片和MCD患者肾脏切片在显微扩张技术下和电子显微镜下的照片。结果显示，显微扩张技术与电子显微镜所显示的细胞结构是一致的。表明，在显微扩张技术下，传统光学显微镜也可以区分临床病理组织样本中纳米级的区别。

此外，为了进一步确定，显微扩张技术是否有助于病理学家进行MCD以及FSGS诊断，研究人员还请来了四位病理学家以及三位非病理学家，在经过培训后，对从3位正常人，2位MCD患者，1位FSGS患者体内提取的10张没有扩张的组织免疫染色显微镜照片以及10张扩张后的显微镜照片进行诊断。

结果研究人员发现，对于未扩张的照片，诊断的准确率只有65.7%。然而对于扩张后的照片，诊断的准确率竟然高达90%。不仅如此，对于扩张后的照片，大家的诊断更容易达成一致，而对于没有扩张的照片，则很容易引起分歧。

正常人体肾脏组织，未扩张的样本（左）分辨率显著小于扩张后的样本（右）（同一显微镜观察）

这些试验证明，显微扩张技术的确是一种简单，高效，准确的方法，有助于疾病的诊断。正如Boyden教授所说，“现在，你诊断肾脏疾病可以无需昂贵的电子显微镜，你只需要一个光学显微镜加上一些化学试剂就够了（7）。”

同样地，乳腺癌的病理检测不仅在临床上有广泛的需求，而且早期乳腺病变的诊断也是乳腺病理诊断中最具挑战性的问题。有研究显示，不同病理学家对于早期乳腺病变细胞核异型性诊断只有50%的一致性（8）。而早期乳腺病变的诊断往往对于指导患者的临床治疗非常重要。

研究人员认为，病理学家对于早期乳腺病变的诊断之所以有很大的分歧，主要有两个原因。首先，早期乳腺癌的诊断标准很大程度依赖病理学家的主观定性判断。其次传统光学显微镜的分辨率是有限的，因此能提供的信息也是有限的。

所以，为了更好的进行乳腺癌的诊断，研究人员开发了新的计算机病理模型用于早期乳腺良性恶性病变的区分。在经过深度学习之后，研究人员使用这一模型来诊断早期乳腺癌。结果，研究人员发现，在进行扩张后的样本中，计算机诊断的 AUC值达到了0.93，而未扩张的样本机器识别的AUC值只有0.71（AUC越接近1诊断越完美，越接近0.5诊断越随机）。

总的来说，显微扩张技术不仅操作简单，而且还大大增加了临床诊断的准确性。准确的诊断不仅让患者更加安心，也使医生能对病人做出更优的治疗方案。所以，显微扩张技术无疑具有广阔的临床应用前景。当然，这一技术的大规模推广还需要更大规模的临床实验来验证。

参考资料：

1.Zhao Y, Bucur O, Irshad H, et al. Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy[J]. Nature biotechnology, 2017.

2.Chen F, Tillberg P W, Boyden E S. Expansion microscopy[J]. Science, 2015, 347(6221): 543-548.

3.Tillberg P W, Chen F, Piatkevich K D, et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies[J]. Nature biotechnology, 2016, 34(9): 987.

4.Chen F, Wassie A T, Cote A J, et al. Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy[J]. Nature methods, 2016, 13(8): 679-684.

5.Chang J B, Chen F, Yoon Y G, et al. Iterative expansion microscopy[J]. Nature, 2017, 201: 7.

6.Ranganathan S. Pathology of podocytopathies causing nephrotic syndrome in children[J]. Frontiers in pediatrics, 2016, 4.

7.http://news.mit.edu/2017/microscopy-technique-could-enable-more-informative-biopsies-0717

8.Elmore J G, Longton G M, Carney P A, et al. Diagnostic concordance among pathologists interpreting breast biopsy specimens[J]. Jama, 2015, 313(11): 1122-1132.