在众多肿瘤免疫治疗方式中，癌症纳米疫苗由于可以训练免疫系统使其对肿瘤抗原敏感进而实现对肿瘤的抑制受到了广泛关注。典型的癌症纳米疫苗总是由肿瘤相关抗原（tumor-associated antigens, TAAs, 用于赋予疫苗特异性）、佐剂（用于免疫激活）及纳米载体（用于增强抗原及佐剂的递送）共同组成。目前，大多数已开发的纳米疫苗仅携带模型抗原，如卵清蛋白等，用于直接对抗单个抗原靶点。然而，考虑到肿瘤的持续进展和遗传异质性，这种纳米疫苗无法引起足够的免疫响应。下一代纳米疫苗制剂需要整合丰富的TAAs，以达到诱导充足的抗肿瘤免疫的阈值。携带了完整膜蛋白矩阵的癌细胞膜有望作为TAAs，用于触发对相应肿瘤的特异性免疫反应。
为了增强癌细胞膜向免疫细胞的递送，可以在癌细胞膜上修饰靶向配体，但这种工程化细胞膜的合成过程复杂且低效。考虑到原位肿瘤疫苗往往通过直接肿瘤治疗，如化疗、放疗或光热治疗等诱导肿瘤细胞凋亡并释放可激活免疫的TAAs，一种可能最大化癌细胞膜免疫调节性能的方法是在提取细胞膜前先诱导癌细胞凋亡。由于凋亡的癌细胞往往会伴随着免疫原性死亡（ICD）的发生，使钙网蛋白（CRT）等ICD标志物外翻至细胞表面，因此凋亡的癌细胞膜（apoptotic cancer cell membranes，AM）也有可能会携带CRT，这将使AM易于被免疫细胞识别摄取以更好地激活免疫。
除了携带的TAAs外，纳米疫苗的肿瘤预防和治疗效果还受到免疫抑制肿瘤微环境（TME）和肿瘤抑制效率不足的阻碍。因此，在激活免疫的同时具备直接杀伤肿瘤能力的多功能纳米疫苗将有望获得增强的肿瘤抑制性能。但如果在纳米疫苗中加入传统的细胞毒性抗肿瘤药物，则可能会对免疫细胞产生不良副作用，抑制免疫细胞活性。利用外部能量或特殊信号仅在肿瘤部位触发治疗的局部疗法因其非侵袭性、特异性和高效性而吸引了越来越多的关注。声动力学疗法（SDT）可通过超声（US）局部激活声敏剂，产生细胞毒性单线态氧（1O2）用于抑制肿瘤生长。此外，SDT能够诱导癌细胞发生ICD，为将SDT用于增强免疫调节提供了可行性。此外，SDT过程中产生的1O2作为活性氧（ROS）的一种，会造成无法修复的DNA损伤并使损伤后的DNA从细胞核逃逸到胞质中，用于激活干扰素基因（STING）通路。
细胞中cGAS-STING通路的激活会促进I型干扰素（IFN）和促炎细胞因子的分泌，这些细胞因子可以熟化树突细胞（DCs），并进一步活化T细胞以激活适应性免疫。除了上述的ROS及一些传统的STING激活剂外，最近的研究表明Mn2+可以直接刺激cGAS、增强cGAS对胞质dsDNA的敏感性并提高cGAMP与STING的结合效率，从而促进STING的激活。
为了最大限度地发挥癌细胞膜、SDT及Mn2+在肿瘤治疗中的优势，东华大学沈明武研究员/史向阳教授团队通过简单的方法合成了AM仿生伪装并包封MnO2 NPs的聚N-乙烯基己内酰胺纳米凝胶（PVCL NGs），用于负载声敏剂Ce6及免疫佐剂cGAMP，制得的基于NGs的治疗型纳米疫苗一方面可以直接激活免疫细胞，另一方面可以直接杀伤肿瘤细胞并诱导ICD，从而通过全周期免疫调节实现有效的肿瘤预防和直接肿瘤治疗（图1）。研究团队首先使用含有硼酸酯键的交联剂，通过沉淀聚合法合成了pH/ROS响应的PVCL NGs。随后，在NGs内原位合成MnO2 NPs、通过Mn-N配位键负载Ce6、通过静电吸附负载cGAMP，并最后表面包覆AM得到了PMCG@AM NGs。
图1. PMCG@AM NGs的合成及其在体内与US联合进行全周期免疫调节示意图。研究团队首先证明了PMCG NGs的合成及Ce6、cGAMP在NGs中的成功负载（图2A-B）。在过表达GSH或H2O2/H+的环境中，NGs中的MnO2 NPs可以转化为Mn2+，实现Mn2+的响应性释放（图2C）。此外，PMCG NGs在将MnO2转化为Mn2+的过程中可以分解H2O2生成O2（图2E），生成的O2不仅可以用于缓解肿瘤乏氧，还可以作为SDT的燃料，增强SDT效果。随后，Mn2+可以进一步催化类Fenton反应生成具有细胞毒性的·OH用于化学动力学治疗（CDT，图2F）。在模拟的TME中，PMCG NGs可在US辐照下高效生成1O2，具有较好的SDT性能（图2G-I）。
图2.（A）PMCG NGs的SEM图；（B）PMC及PMCG NGs的UV-vis吸收光谱；（C）不同条件下PMCG NGs释放Mn2+情况；（D）不同条件下MnO2的转化；（E）不同NGs在H2O2溶液中产生O2情况；（F）PMCG NGs在不同GSH浓度下对MB的降解百分比；分散在（G）超纯水中或（H）分散在模拟TME溶液中的PMCG NGs产生1O2情况及（I）产生速率。随后，考虑到Ce6的声动力学特性，研究团队利用free Ce6和US共同诱导B16-F10细胞凋亡以提取AM，并通过一系列细胞实验优化了提取AM的实验条件（图3A-D）。为了研究凋亡前后细胞膜蛋白表达水平的变化，对凋亡前后的B16-F10 细胞进行了4D Label free定量蛋白组学分析。相比于PBS处理的B16-F10细胞，在经Ce6及US共处理后的细胞中共有3272个表达差异蛋白，其中13.08%的差异蛋白定位在质膜上。根据基因本体论分析的生物过程对位于质膜上的差异蛋白进行分类（图3E）。结果显示，共有67个差异蛋白与免疫系统过程有关，这表明Ce6/US 诱导的细胞凋亡可能影响免疫相关蛋白在细胞膜上的表达，从而调节细胞膜的免疫活性。接下来，将提取的AM与制备的PMCG NGs共挤出，获得了PMCG@AM NGs。TEM图像显示，包覆AM后NGs的尺寸约为115 nm，并可观察到细胞膜碎片包裹在NGs表面（图3F）。包覆了AM的PMCG@AM NGs仍然能够催化产生O2（图3G）、在US辐照下产生1O2（图3H）及生成·OH（图3I）。
图3.（A）AM提取示意图；经不同浓度Ce6处理的B16-F10细胞在US辐照前后细胞内（B-C）ROS水平及（D）凋亡率；（E）根据蛋白组学结果分析膜蛋白的变化；（F）PMCG@AM NGs的TEM图像；PMCG@AM NGs产生（G）O2、（H）1O2及（I）·OH情况。随后，研究团队分析了PMCG@AM NGs在体外直接激活免疫细胞的能力。实验结果表明，与PMCG@AM NGs共孵育后，DCs及巨噬细胞中Mn的含量明显增加，表明包覆AM使NGs更容易被免疫细胞识别和吞噬，这将有利于NGs向免疫细胞呈递TAAs及免疫佐剂（图4A）。PMCG@AM NGs在较低浓度时对免疫细胞未表现出显著的细胞毒性，表明基于Mn的CDT和基于Ce6的SDT在免疫细胞中并未被触发（图4B-C）。PMCG@AM NGs在被免疫细胞吞噬后，可以递送TAAs及负载的免疫佐剂，激活STING通路，使相关细胞因子释放并促进DCs的熟化，为将其作为纳米疫苗在体内诱导特异性抗肿瘤免疫响应提供可行性（图4E-I）。
图4.（A）B16-F10细胞、DCs或RAW细胞与不同NGs共孵育后细胞内Mn的吞噬量；不同NGs与（B）DCs及（C）RAW细胞共孵育24 h后的细胞活力图；（D）NGs直接激活免疫细胞示意图；经不同处理后（E-F）DCs或（G-H）RAW细胞释放的IFN-β及TNF-α；（I）经不同处理后DCs熟化情况的流式分析图。随后，研究团队在小鼠体内研究了PMCG@AM NGs作为纳米疫苗预防肿瘤生长的能力。首先，PMCG@AM NGs可以在小鼠淋巴结中聚集（图5A）。利用PMCG@AM NGs进行三次疫苗接种免疫后，小鼠体内淋巴结中DCs熟化增加、脾脏中效应T细胞和细胞毒性T细胞大量分化、血清中相关细胞因子的表达水平明显升高，表明PMCG@AM NGs成功激活了STING介导的免疫应答，引发了抗肿瘤免疫响应（图5B-E）。在验证了PMCG@AM NGs可以引起免疫响应后，在疫苗接种后的小鼠体内研究了激活的免疫反应抑制肿瘤生长的能力。研究团队发现，接种了PMCG@AM NGs的小鼠体内肿瘤的生长速度明显低于其余各组，表明PMCG@AM NGs在体内激活的免疫响应使免疫系统可以特异性识别肿瘤细胞，从而有效地抑制肿瘤生长（图5F）。此外，经NGs疫苗免疫后小鼠脾脏中记忆T细胞的百分比增加，表明PMCG@AM NGs不仅可以在体内激活免疫响应以保护小鼠免受肿瘤的攻击，还可以诱导长期免疫响应（图5G-H）。
图5.（A）不同NGs在小鼠淋巴结中的积累；（B）体内疫苗免疫及肿瘤挑战时间线；（C）经3次疫苗免疫后各组（C）淋巴结中DCs熟化、（D）脾脏中T细胞分型的流式分析图及（E）血清中相关细胞因子的表达情况；（F）肿瘤挑战实验中各组小鼠肿瘤体积变化；（G-H）经不同治疗后第21天小鼠脾脏中记忆T细胞的百分比。在讨论了PMCG@AM NGs作为纳米疫苗的免疫激活能力后，研究团队接下来评估了PMCG@AM NGs的直接肿瘤杀伤能力。PMCG@AM NGs在US辐照后可实现最有效的癌细胞抑制，通过CDT/SDT在细胞内产生ROS并消耗GSH，从而诱导显著的癌细胞凋亡（图6A-F）。随后，研究团队评估了NGs是否能激活癌细胞中的cGAS-STING通路。实验结果表明，NGs可利用负载的cGMAP、Mn及CDT/SDT过程中产生的ROS激活B16-F10细胞内的STING通路，使免疫相关细胞因子分泌增加（图6G-I）。此外，NGs还可通过CDT/SDT诱导癌细胞发生ICD，释放损伤相关分子模式（DAMPs）刺激免疫细胞熟化。
图6.经不同处理后B16-F10 细胞的（A）细胞活力图、（B）细胞内GSH 消耗百分比及（C-D）1O2表达水平；经不同处理后B16-F10 细胞（E）凋亡情况流式分析图及（F）死活染色的CLSM图；经不同处理后B16-F10 细胞释放的（G）IFN-β 、（H）TNF-α及（I）细胞内STING通路相关蛋白的WB试验结果图。最后，研究团队建立了B16-F10双侧皮下瘤模型，用于研究PMCG@AM NGs + US的体内肿瘤抑制效率及免疫激活性能。PMCG@AM NGs可通过Mn2+催化的CDT在一定程度上抑制原发瘤及远端瘤的生长，并通过对原发瘤中进行局部的SDT进一步显著抑制原发瘤的生长。治疗后小鼠淋巴结中DCs熟化增加、双侧肿瘤中浸润的效应T细胞及细胞毒性T细胞比例增加、双侧肿瘤中免疫相关细胞因子表达增加，表明除了直接进行的CDT/SDT，PMCG@AM NGs及US诱导的免疫反应在抑制肿瘤生长方面也起着至关重要的作用，可显著抑制远端瘤的生长（图7）。
图7.（A）体内抗双侧肿瘤治疗时间线；治疗期间各组小鼠（B）原发瘤及（C）远端瘤体积变化；经14天治疗后各组（D-H）原发瘤及（J-N）远端瘤中T细胞分型、细胞因子表达情况、TUNEL染色分析、CRT染色分析及肿瘤细胞凋亡率。总的来说，该研究设计的NGs具有多个优势：1）NGs的双重响应性使其能够在特定条件下选择性解离，实现可控的药物释放；2）提取的AM既可维持癌细胞膜的靶向能力，还可增强膜蛋白的免疫原性使其更易被免疫细胞识别吞噬；3）Mn2+、cGAMP和AM的联合使用可以通过激活STING通路熟化免疫细胞，并向T细胞呈递TAAs以实现特异性肿瘤预防；4）US辐照的加入可在肿瘤部位触发局部SDT，与Mn2+介导的CDT联合作用诱导ICD，ICD诱导的免疫反应与NGs直接激活的免疫应答协同作用，完成全周期免疫调节，有效抑制双侧肿瘤的生长。以上研究成果以“A polymer nanogel-based therapeutic nanovaccine for prophylaxis and direct treatment of tumors via a full-cycle immunomodulation”为题，在线发表于国际著名期刊Bioactive Materials (DOI: 10.1016/j.bioactmat.2024.09.024)。东华大学生物与医学工程学院史向阳教授、沈明武研究员与荷兰埃因霍温理工大学Jan C.M. van Hest教授为共同通讯作者，东华大学博士生郭云琦为第一作者。该工作得到了国家自然科学基金区域创新发展联合基金项目、国家自然科学基金委外国资深学者项目及上海市科委政府间国际合作等项目的资助。
文章链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2452199X24004195
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