清华大学深圳国际研究生院陶益团队WR：环境浓度环丙沙星对蓝藻的致死效应——抗生素-光合蛋白结合的影响

成果简介

近日，清华大学深圳国际研究生院陶益副教授团队在环境领域著名学术期刊 Water Research 上发表了题为“ Variable cyanobacterial death modes caused by ciprofloxacin in the aquatic environment: Prioritizing antibiotic-photosynthetic protein interactions for risk assessment ”的研究论文 。文中识别了环境浓度环丙沙星在典型水华蓝藻铜绿微囊藻细胞内的多重靶位点：除了结合 DNA 回旋酶造成 DNA 损伤之外，环境浓度环丙沙星在不同暴露水平下对铜绿微囊藻不同光系统反应中心产生差异化结合。这种差异化结合造成蓝藻细胞内不同的碳氮代谢调控模式，使藻细胞在 DNA 损伤下执行不同的程序性死亡模式 。本研究为进一步评估和预测环境浓度抗生素水生态风险提供了新的见解 。

引言

不断排放到水环境中的抗生素能够和不同的光合蛋白表现出高亲和力结合，干扰光合生物的能量代谢和生长，进而影响水生态系统的初级生产力。然而，当前的研究将抗生素对光合生物的亚致死作用主要归因于对光系统 II （ PSII ）蛋白的损伤，而忽略了 PSI 蛋白作为潜在靶标的可能。在本研究中，我们研究了环境浓度（ 3-8 μg/L ）环丙沙星（ CIP ）对典型水华蓝藻铜绿微囊藻的致死效应。研究发现， 3-8 μg/L CIP 通过损伤蓝藻细胞的 DNA 造成细胞程序性死亡。此外，在不同暴露水平下， CIP 对不同光合蛋白存在差异化损伤并影响了蓝藻细胞的死亡表型。具体来说， 3 μg/L CIP 仅同 PSII 的反应中心 D1 蛋白结合，上调了细胞三羧酸循环和脯氨酸分解代谢，以获取 ATP 。这有利于细胞类凋亡（ AL-RCD ）的执行。然而，除了结合 PSII 上的 D1 蛋白之外， 8 μg/L CIP 还能够和 PSI 的铁 - 硫簇中心蛋白结合，造成整条电子传递链的崩溃，诱导碳和精氨酸饥饿。这使藻细胞死亡模式从 AL-RCD 转变为 mazEF 系统介导的 RCD （ mazEF -RCD ）。此外，在 AL-RCD 和 mazEF -RCD 细胞中， MC-LR 的被动释放水平和生物合成能力分别得到增强，表明 CIP 暴露后 MC-LR 风险的提升。本研究强调了抗生素与不同光合蛋白之间复杂的相互作用，这些相互作用能够改变不同环境浓度暴露水平下抗生素的致死效应。从化合物 - 光合蛋白相互作用的角度出发，该项研究能为评估和预测环境浓度抗生素的生态风险提供新的视角。

图文导读

环境浓度 CIP 和 光系统反应中心的结合

图 1 ：环境浓度 CIP 胁迫下蓝藻 (a) PSII 光量子产率和 (b) 光系统电子传递速率的变化。 8 μg/L CIP 暴露组 vs 3 μg/L CIP 暴露组差异基因的 (c) GO 富集分析和 (d) 火山图。 (e) CIP 和 PSII D1 蛋白以及 PSI Fe-S 簇中心蛋白的分子对接。

首先，通过光合电子传递速率检测、 PHYTO-PAM 检测和转录组学分析评估了 CIP 暴露对铜绿微囊藻细胞光合系统的损伤。 3 μg/L 以上的 CIP 对 PSII 的有效光量子产率 [ Y (II)] 造成浓度依赖的持久性损伤（图 1a ），并且降低了 PSII 中的电子传递速率（图 1b ）。在 3 和 8 μg/L CIP 暴露的蓝藻细胞中， PSII 的电子传递速率分别降低了 38% 和 97% （图 1b ）。然而，在 8 μg/L CIP 暴露的蓝藻细胞中， PSI 的电子传递完全崩溃（图 1b ）；而在 3 μg/L CIP 暴露下，蓝藻细胞 PSI 的电子传递速率并没有显著变化（下降约 ∼ 10% ），表明该暴露水平对 PSI 微弱的损伤。通过比较 3 和 8 μg/L CIP 暴露下细胞的转录组数据发现， 8 μg/L CIP 暴露下蓝藻细胞的差异基因（ DEGs ）显著富集在 PSI 中（图 1c ）。在这些 DEGs 中， psaC 是变化最显著的下调基因 [-1.21 log2|FC| ， FDR = 0.00068] 。

CIP 对 PSII D1 蛋白具有更高的亲和力，但在高暴露水平下其也能够结合 PSI Fe-S 簇中心蛋白。通过分子对接计算验证上述结果。模拟计算结果显示（图 1e ）， CIP 通过氢键和疏水作用力同 PSII 的 D1 蛋白和 PSI 的 Fe-S 簇中心蛋白分别产生 -9.28 和 -5.18 kcal/mol 的结合能，表明 CIP 对 PSII D1 蛋白有更高的亲和力；但是随着暴露水平的增加， CIP 同 PSI Fe-S 簇中心蛋白的高亲和力导致了 CIP 对 PSI 的损伤。

环境浓度 CIP 造成的细胞裂解和毒素风险

图 2 ：环境浓度 CIP 胁迫下蓝藻 (a) 比生长速率， (b) 死亡率和 (c)(d) 细胞尺寸的变化。 MC-LR(e) 释放率和 (f) 单细胞合成能力的变化。

3 和 8 μg/L CIP 造成蓝藻细胞在 21 天暴露时间内持续的细胞裂解，最大裂解率达到 70% 左右（图 2a ）。同时，在细胞持续裂解的过程中，蓝藻细胞的双链 DNA （ dsDNA ）含量降低，死亡率增加（图 2b ）。 3 μg/L CIP 暴露使蓝藻细胞的死亡率在 7 天内持续增加至 60% 左右（图 2b ）。然而，在 8 μg/L CIP 暴露下，细胞死亡率在 7 天内稳定在 25% 左右（图 2b ），这表明环境浓度 CIP 在蓝藻细胞中引发了不同的死亡模式。除此之外， 3 和 8 μg/L CIP 暴露造成细胞尺寸的显著变大，增长至对照组细胞的 1.5 倍左右（图 1c 和 1d ）。以上结果表明环境浓度暴露下蓝藻细胞 DNA 受到不可修复的损伤，最终导致细胞的死亡和裂解 。

3 和 8 μg/L CIP 造成了不同的 MC-LR 风险模式。 3 μg/L CIP 暴露使得 MC-LR 的被动释放水平在 7 天内较对照组显著提升 9 倍（图 1e ），而单细胞合成能力得到抑制 ( 图 1f) 。 8 μg/L CIP 暴露则使得 MC-LR 的单细胞合成能力在 7 天内较对照组显著提升 4 倍（图 1f ），而释放水平则没有显著的变化（图 1e ）。

环境浓度 CIP 造成的不同细胞程序性死亡模式

图 3 ：环境浓度 CIP 胁迫下蓝藻 (a) 膜通透性和磷脂酰丝氨酸（ PS ）外翻以及 (b) Caspase-3 酶活性和 DNA 断裂水平的变化。 (c) 不同程序性死亡模式下细胞形貌的观察。 (d) SOS 响应和 mazEF 系统基因的表达模式。

环境浓度 CIP 造成的不同碳氮代谢调控模式

图 4 ：环境浓度 CIP 胁迫下蓝藻 (a) 关键光合蛋白编码基因和 (b) 核心碳氮代谢路径的变化。

环境意义

图 5 ：未来抗生素生态毒理研究和管理的工作框架。

长期以来，蓝藻一直被作为评估水环境中抗生素生态风险的敏感筛查工具，该过程通过计算 EC ₅₀ 和风险熵值来比较和评价抗生素的风险。然而，蓝藻的缓慢生长使得 EC ₅₀ 的计算需要 7 天以上的暴露时间。本研究中，蓝藻细胞的裂解从暴露后的第 3 天开始。此外， EC ₅₀ 值的计算取决于抗生素种类。在我们的工作中，给出 CIP 的 EC ₅₀ 值很困难，因为我们观察到不同 CIP 浓度暴露下几乎一致的细胞生长抑制和裂解（图 2a ）水平。因此，在本研究中， EC ₅₀ 值的计算不是一项可靠的评价指标。

为了规避细胞生长抑制作为毒性终点的潜在问题，研究者通过测量光量子产率来快速评估抗生素的毒性。然而，对于 3 μg/L CIP ，我们在暴露后的第 1 天已经观察到 PSII 电子传递速率的下降（ 50% 左右）（图 1b ）；然而此时我们并没有检测到 Y (II) 的显著下降（图 1a ）。此外，仅评估该参数忽略了不同环境浓度暴露下 CIP 对不同光合蛋白损伤的差异性极其毒性的异质性。因此，本研究建议开发一种更灵敏的技术来详细评估和预测抗生素在光合生物中的毒性。具体来说，未来的工作应该侧重于化合物 - 蛋白质的相互作用及其对蓝藻生理的影响，并尝试开发机器学习来预测抗生素的毒性（图 5 ）：

i) 通过基因表达变化、光量子产率和光合电子传递速率测量以及分子对接等综合手段来识别抗生素与光合蛋白之间的相互作用。需要重点研究在增加抗生素暴露水平时是否存在多个光合靶标。

ii) 需要通过对蓝藻细胞能量 / 毒素代谢进行生化 / 组学分析来研究和比较不同抗生素暴露水平下细胞的生理反应。

iii) 收集和整理上述数据用于训练机器学习。在输入光合蛋白和抗生素的结构以及抗生素剂量等信息后，该机器学习程序能够预测靶标光合蛋白、细胞的生长速率或 RCD ，以及不同暴露水平下的蓝藻毒素风险。

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在本研究中，我们揭示了环境浓度 CIP 与铜绿微囊藻细胞中 PSII 和 PSI 反应中心蛋白的浓度依赖性结合。 3 μg/L CIP 与 PSII D1 蛋白结合，而 8 μg/L CIP 同时与 PSII D1 和 PSI Fe-S 簇中心蛋白结合。这导致下游碳氮代谢的差异化调节。在大多数研究中，这种和光合蛋白的差异化结合无法通过光量子产率的测量来识别。碳氮代谢的差异化调节影响了蓝藻细胞对 DNA 损伤的响应，最终导致 3 和 8 μg/L CIP 暴露下蓝藻细胞分别执行 AL-RCD 和 mazEF -RCD 。伴随细胞死亡， MC-LR 的被动释放水平（ AL-RCD 细胞）和单细胞合成能力（ mazEF -RCD 细胞）增强，表明单一抗生素胁迫下 MC-LR 风险水平的差异。总的来说，我们的研究阐明了抗生素 - 光合蛋白结合、碳氮代谢调节以及多样化蓝藻 RCD 模式之间的关系 。

然而，需要更多的研究工作来使得这些结果更具有普适性，包括对不同作用模式的抗生素以及在形态和结构上与铜绿微囊藻不同的其他蓝藻物种的研究。此外，有必要探究抗生素重复暴露对蓝藻光合系统损伤的复杂性。

尽管本研究存在上述不足，但未来水生环境中抗生素的研究和管理应侧重于但不限于以下三个方面： i) 应针对抗生素对光合生物的生态风险进行更全面的评估，包括高于传统毒理效应阈值的致死效应； ii) 有必要对抗生素毒理效应的异质性开展细致的研究； iii) 识别化合物 - 蛋白质相互作用对于解释多样的毒理效应以及评估 / 预测抗生素风险是不可或缺的。

本研究得到了国家自然科学基金委和深圳市科创委的资助。