作者：高志磊
来源：贾半仙聊诊断
除了专利壁垒这个先决条件外，成为PCR界的巨头不仅要迅速抢占
新技术带来的先发优势
，还需要在恰当的
入场时机
进行商业化，给外界印象最深的就是引领市场、具有竞争力的代表性产品，接下来我们回顾一下巨头成为巨头的硬实力。
背景知识：
qPCR仪器一般由3部分组成，其中前两个为硬件系统，也就是招标参数里常见的升降温速率、检测荧光通道数…等等。
接下来我们逐一看看三巨头的主力产品：
一、赛默飞世尔（Thermo Fisher & ABI）
Thermo Fisher& ABI无疑是这个领域的绝对霸主，产品线非常丰富，做到了全方位无死角覆盖：
从低端的入门级Quant Studio 1，
到中端的QS1Plus、QS3、7500，再到QS5、QS6等高端仪器，再到QS7、QS12K等超出常规qPCR仪范畴的超高端仪器，拥有3/4/6不同检测通道、96孔、384孔、Pro、Flex、TaqMan Array、OpenArray以及数款Dx等各种型号，兼容100ul反应体积（这点对IVD客户非常友好）。
客户群体非常广泛，涵盖各种工业用户，如IVD研发/生产/终端，BioPharma/Biotech，政府实验室（CDC、动物CDC、海关等）、各类科研/教学用户等，很多人在学生时代使用的第一台qPCR仪器就是ABI品牌，包括笔者本人。
目前毫无疑问qPCR的第一品牌就是ABI，用户忠诚度高，产品议价能力强。在笔者看来，形成压倒性优势的原因在于：
先发优势+标准化
。
先发优势好理解，它的PCR专利源自PE-Cetus合资公司，苗红根正，又和Roche同时代进行早期商业化的公司，率先推出世界上第一台qPCR仪（当时已被PE收购），始终处于第一梯队。
另外一个是标准化，按照前赛默飞全国临床市场战略总监，现
阅尔基因CEO柴映爽先生
的话来说：
ABI的成功之处在于推动了qPCR的标准化，包括定义了我们熟知的96孔标准版仪器（12x8），还包括PCR试剂（如DNA聚合酶、RT酶、抗抑制剂等）、塑料耗材（如8联管、96孔板），构建起完整的上下游生态系统，形成了现代人人熟悉的qPCR解决方案，使得ABI的qPCR解决方案深入人心，这是最关键的成功因素。
在那个草创时代，大家都不知道qPCR仪应该是一个什么形态，ABI无疑开创了一个新时代，它的技术路线影响了一大批后来者，这些成就使ABI在qPCR仪领域确立了无可争议的领导地位。
此外笔者基于工作接触和行业见闻，还窥见了ABI的一些成功因素：
庞大的下游应用
：应有尽有，非常细分，可提供＞230万个kit，可以和自家的试剂总数比较就知道差距了。
一些小众研究用的产品也能买到，再加上一些非Thermo不可的独家试剂，这是Thermo可怕的杀手锏：有thermo的品牌背书，客户也不用选来比去，反正都有，直接买就行了，这种购买决策的心智模式一旦形成就是无敌的状态。
比如qPCR仪上的一个小众功能——利用FRET通道进行蛋白质热稳定性分析，所以这也是个冷知识，下次有人说qPCR仪只能做基因分析，你可以告诉他其实也可以做蛋白研究。
目前笔者只看到只有Thermo能提供仪器+试剂（如SYPRO Orange protein gel stain）+数据分析软件的完整解决方案，很多厂家缺少后面2个。
商业模式灵活
：秒杀一众同类公司
GSD有专门的OEM团队，据笔者了解已经和国内合作厂家一起落地了数字PCR（如泛生子OEM的QuantStudio 3D）和一代测序仪（如阅微基因OEM的SeqStudio 基因分析仪）的项目，都获得了二类IVD注册证。
阅微基因OEM的智阅基因分析仪（京械注准20212220099），也就是，自动化程度高，具有Sanger测序和片段分析两大功能。
国产化落地迅速
：短短的三年间，先后落地了3个重要产品，有2款qPCR仪和1款普通PCR仪，具体如下。免去了繁琐的进口论证流程，同时顺应国产化的大趋势，在只要国产产品的招标中将获得更多业务机会。
相信大家能深深感受到Thermo Fisher经常提到的理念：In China，For China，这点确实没有说空话。
强大的售后支持：
ABI的远程售后支持团队，可以在接通用户电话时，面前没有电脑和其他资料，根据用户的问题，直接告诉对方如何一步一步进行troubleshooting，看到这一幕的笔者简直惊呆了，目前这一点没有哪个厂家能做到，差距就是这样拉开的。
其他优点
：接下来涉及到其他家的缺点基本上都是它的优点。
接下来以2款主力机型进行解析：
ABI Prism 7500
：
市面上最经典的qPCR仪——7500，号称行业金标准，于2004年上市，比Stepone/Step one plus还早3年。
因为上市早，市场认可度高，出货量大，被一众竞品各种diss，对于相信ABI品牌的客户来说没有用，但架不住众口铄金、三人成虎，还是动摇了一部分客户，因为竞品的说辞确实有道理，ABI价格又那么高，虽然后来新增了Fast模块来弥补，但技术参数还是稍显落后。
之前一直传言要退市，但因为疫情一直延期，目前已经到了产品生命周期的终点了，据说被西安某qPCR本土厂家接收了库存和品牌，起了个新名字AURORA 7500 qPCR仪（AURORA与KHB Polaris更配哦），也算是为中国市场最后一次发光发热了。
温控系统
：利用Peltier效应来精准控制温度，但没有温度梯度功能来摸索最适合的Tm温度。
光学系统
：由光源卤钨灯＋CCD拍照＋透镜、滤光片等组成。
竞品主要攻击的点集中在光学模块：
1）
光程差
：竞品认为从光源到PCR板/管中间和边缘，光走过的距离不同，因此存在光程差，此外激发光从顶部发出到达每孔的强度不一样，与边缘的孔相比，中心区域的孔可以检测到更高的荧光信号。
竞品认为ABI为了解决光程差的问题，引入了ROX校正。ROX是一种很好的惰性参考染料，其荧光信号并不随着PCR扩增而增强，也不受qPCR反应的影响，因此只要qPCR混合液的性质保持不变，那么它在整个qPCR过程中也会保持稳定。
基于这个原因以及ROX优越的光谱特性，可用于荧光信号的归一化处理，以校准光程差引起的荧光变化。但是ROX作为参比染料的问题在于，它占用了一个可用于检测靶标的荧光通道。
但ABI不这样认为，他们认为ROX的真正作用是：在qPCR反应中有许多反应本身的物理因素会影响信号检测，从而造成孔间数据的差异。
例如：PCR反应板本底信号不均一，PCR管盖厚度有差异，同一反应体系在分装时出现了差异等因素。所以ROX能帮助用户通过均一化校正而消除这些因素的误差，从而提高数据精确性，主要用于纠正由于qPCR反应本身的物理因素而导致的荧光信号变化，帮助排除可疑数据。
ROX校正争议较大，正反两方说的都有一定道理，就看哪方能给终端用户洗脑，客户更愿意相信哪个，谁有闲工夫关心真实情况到底如何。
目前市面上的qPCR仪器分为不需要ROX校正、需要高浓度ROX校正以及需要低浓度ROX校正的三种仪器，当我们在选择qPCR预混试剂时，要注意选择含有适配于当前机型ROX的qPCR试剂，否则可能会有BadRox报错情况发生，BadRox报错是因为更换qPCR仪器后，试剂中添加的ROX浓度与仪器不匹配导致的。
关于ROX校正，来自Thermo 官方的信息如下：
第一，ABI的荧光定量预混液已经包含了最佳浓度的ROX™，因此用户无需再额外添加。
第二，所有ABI实时荧光定量PCR软件是默认检测ROX并使用均一化数据。如果选用的试剂盒或者预混液不含ROX，根据对实验的精度的要求不同，可以另外采购ROX摸索最佳浓度优化实验，也可以将参比荧光染料选项改为None（无），放弃ROX校正。在没有ROX存在的情况下，建议选择参比荧光为None进行数据分析。
2）
竞品攻击CCD拍照模式有弊端
。
CCD英文全称：Charge coupled Device，中文全称：电荷耦合元件，这是一种半导体器件，能够把光学影像转化为数字信号可以称为CCD图像传感器。
CCD照相机具有强大的自扫描功能，图像清晰度好，可以随时捕捉图像，支持多重合并像素模式。
这么好的东西为什么会被吐槽了呢？
原因在下图，因为7500的CCD拍照时需要样本模块和软件预设的位置保持一致，否则会导致某些荧光信号缺失。
很多情况会导致预设位置和实际位置不一致，比如搬动、震动，ABI的解决方式是定期每六个月进行位置校正，说明书上称之为ROI校正（Region of Interest calibration）。
此外还有卤钨灯被诟病半年需要更换一次，后期使用成本高。
简要总结一下ABI光学模块设计被吐槽的两点，竞品公司宣称通过其他技术手段避免了这些缺点，形成了不同的技术路线。
Quanta Studio 5
：
QS5是7500的替代产品，其实QS5与QS3为互为姊妹型号，说明书都是两个型号放在一起，硬件上的差异较少，一个主打中端，一个主攻高端，这里就放在一起讲。
聪明的读者看了上面的介绍，就会想到与7500同样的问题，也是竞品容易攻击的一点：ROI校正。
用于CCD相机成像的荧光定量PCR仪，相机拍摄的96孔照片和仪器默认的识别框之间不一定是对齐的，必须周期校对，使识别框和拍摄图像中的真实样品孔位置重合，官方说明书也是如此推荐，一般是0.5-2年一次，其他除外，如搬动、维修等。
最后放上ABI 的qPCR仪全家福，期待ABI推出更多经典的型号。
二、Bio-Rad CFX 系列
上篇我们讲到了Bio-Rad是由于收购MJ Research进入到qPCR领域（所以Bio-Rad CFX 系列qPCR仪有些MJ的影子），后来随着专利赔偿和解后才真正稳定下来，但是这仅仅是入门，后续的发展要靠自己，套用一句话：Bio-Rad的成功，当然是靠自我奋斗，但是也要考虑到历史的进程。
自我奋斗
：
1、珀耳帖（Peltier）效应
MJ或者Bio-Rad最大贡献是将物理学上常见的珀耳帖（Peltier）效应应用到qPCR仪器上，同行们无一例外都采用了这种技术手段实现精准的温控。
J.C.A.珀耳帖在1834年发现：当有电流通过不同的导体组成的回路时，除产生不可逆的焦耳热外，在不同导体的接头处随着电流方向的不同会分别出现吸热、放热现象，这就是珀耳帖效应。
金属材料的帕尔帖效应比较微弱，而半导体材料则要强得多，因而得到实际应用的温差电制冷器件都是由半导体材料制成的。
简单来说就是通过在半导体上加上电压，再根据需要改变电流方向就能实现准确的升降温，对于半导体和电的应用，人类熟悉的不能再熟悉了，技术上非常容易实现，成本很较低。
2、Bio-Rad在保证性能的提前下，成本做到同类中最低（进口）
成本低和Bio-Rad采用的技术路线有关，业内同行推出的某些产品中可以看到Bio-Rad的影子。
1）
温控系统
：珀耳帖效应+蜂巢式样本反应模块，同时具备温度梯度功能（Bio-Rad全系PCR仪都有该功能，包括普通PCR）。
蜂巢式样本反应模块其实就是镂空的类似蜂窝状样本反应模块，通过镂空结构来减少整体的质量，从而提高升降温速率，缩短达到指定温度的时间，Bio-Rad已经申请了专利。
2）
光学系统
：由LED光源+滤光片+PD检测器+步进马达等组成，Bio-Rad称之为：固态光梭技术（Solid-stage optics shuttle），该技术宣称有如下好处，可避免ABI的光学设计缺陷：
固态光梭技术示意图，右图为上一代CFX Touch的步进马达，新一代CFX Opus也是相同原理，步进马达控制光梭的移动，误差控制在3um之内。
⑴ 每个LED单独激发和检测，每个反应孔单独激发/检测，无交叉干扰，最大限度地激发荧光信号，单独激发，没有荧光素之间的交叉干扰，更适合多重检测。
检测器成倒S型扫描每个孔逐一采集所有反应孔荧光信号
⑵ 光源/检测器到每个反应孔的距离一致，无光程差，
无需参比荧光染料校正
（ROX）；光源/检测器始终对准每个反应孔，没有错位，无需
位置校正
（ROI calibration）。
其他好处包括无需装机校准，即装即用，后续也不需要经常维护，后期总使用成本降低。
总结一下Bio-Rad CFX的光学系统：LED光源、滤光片、PD检测器和步进马达，听起来都不是什么难以实现的技术，相反很容易，所以这套简便有效的技术路线Bio-Rad一直没有更换。
笔者大胆猜测Bio-Rad R&D应该尝试过新的技术路线，要么同性能的方案成本高、成本低的方案性能差，再或者是专利上的限制，所以还是选择了老的、稳定的技术路线
关于qPCR仪器的成本，大家可以参照IVD研习社黄工整理的qPCR仪器中的核心零部件的价格，大家可以大胆猜测一下Bio-Rad CFX qPCR仪的成本（不考虑美元与人民币的汇率，只考虑绝对数值）。
千万不要轻易嘲笑Bio-Rad或者ABI的技术参数难看，比如技术参数要么万年不变，要么每次发布新品只提升了一点点，我们要谨记是qPCR仪器是一个非常成熟的技术，想要大幅创新基本上不现实，这两个品牌在全球市场竞争中杀出重围，占据第一第二的位置，肯定经历了市场的反复检验，产品有强大的竞争力，我们要心存敬畏，抱着学习的态度，正所谓它山之石可以攻玉。
3、差异化策略：
紧跟ABI，主打性价比，跟在Thermo后面收割剩余想要进口的客户，稳稳的做到了行业老二。这套策略在行业上行期、市场空间足够大的时候很管用，但现在这个优势正在消失了，因为Thermo也开始降价了，压缩了Bio-Rad的销售机会。
4、专注在基因检测整体解决方案：
MIQE指南特别重要，因为不恰当的使用 qPCR 技术很容易得到毫无意义的结果。MIQE指南是qPCR领域内最权威的国际指南，堪称“圣经”级别的存在。
MIQE 指南（Minimum Information for publication of Quantitative real-time PCR Experiments，即发布 qPCR 实验数据所需的最少信息）于2009 年横空出世，该指南规定了获得可靠结果所需的最低限度的关键实验参数和注意事项，是一个涵盖最佳实践和常识性理论指导，目前是《Clinical Chemistry》中被引用次数第二多的论文，目前 Google scholar 的引用数量＞15,000。
MIQE 的最终目标是建立一个明确的框架，在此框架内进行 RT-qPCR（qPCR）实验，并为审稿人和期刊编辑提供一个公认的标准，用于提高实验数据的透明度，评估待发表文章的质量。使用并遵循 MIQE 指南将最终产生更一致、更有可比性和更可靠的数据和结论，同时其他研究者能够重复出研究结果。
Bio-Rad一直在大力提倡和遵循 MIQE 指南的理论指导，并发展出一套符合 MIQE 指南的覆盖 qRT-PCR 实验全流程的解决方案，涵盖从实验设计到数据分析等 6 大部分，具有完善的qPCR仪、分析软件、试剂、塑料耗材等基因研究产品线。
历史的进程：抓住了风口
Bio-Rad赶上了基因组学蓬勃发展的黄金20年，手握有基因表达产品线这个基础应用工具，赚的盆满钵满。后来审时度势，开辟了数字PCR这个新赛道，这次独领风骚，占据数字PCR第一品牌的宝座。
缺
点：
1）商业模式不够灵活。
2）对IVD等工业用户不太友好：大体积反应体系需要单独购买Deepwell型号，不但增加了采购成本，而且增加了PCR的反应时长。
三、Roche
Light Cycler
系列
一句话来总结：曾经的王者，但目前在qPCR仪领域有种落寞的感觉。
独立的qPCR仪，如常见的Light Cycler 96、Light Cycler 480也都上市好多年了，一直没有更新换代，目前主要重心在临床检验IVD领域的全自动化分子检测一体机（如最新的5800系统），更侧重于PCR模块的整合，相对而言对纯qPCR仪的倾斜力度就少了。
如上篇所述，qPCR技术发明之后，Roche就将之用于HIV RNA病毒载量的定量检测，可能是这个主导思路一直延续到如今。
在2023年年末笔者注意到Roche推出了Light Cycler Pro，支持来自罗氏子公司TIB Molbiol的200多种LightMix模块化研究分析和60多种LightMix CE-IVD分析，拥有7个光学通道以及增强的热循环温度控制设置，Roche计划用PRO取代LightCycler 480。
综合Genome Web外网透露的产品信息如下：
-
PRO是第一个支持RUO和IVD双检测的LightCycler qPCR系统，可以帮助实验室将LDT的解决方案从转化研究转移到临床应用环境
-
PRO系统中增加了第7个通道，提升了系统的灵活性，旨在进一步支持更多重qPCR检测和综合征panel。客户可以在PRO系统上运行来自任何市售检测产品。其中，TIB Molbiol的LightMix模块化单重检测，可以通过混合用于创建定制的多重检测，例如呼吸道感染panel。目前，TIB Molbiol已经开发了200多种RUO检测方法，有60种获得CE-IVD标记，其灵活性与LightCycler PRO系统非常匹配
-
PRO可以通过从单个仪器中实现更多的效用来减少实验室支出。在台式系统中使用PRO的RUO/IVD灵活性检测有助于降低用户的成本，不需要单独的专用研究和IVD检测系统
可以看出Roche最新推出的LightCycler PRO在试图重新定位并强化其在qPCR领域的影响力，特别是在RUO和IVD双重检测应用上，力求通过技术创新与多样化检测能力吸引目标用户。
LightCycler qPCR
系统简要发展历程
-
最初，LightCycler qPCR系统是由犹他大学和Idaho技术公司联合开发，也就是上篇提到的Carl Witwer大神创立的公司
-
LightCycler qPCR技术于1997年被授权给Boehringer Mannheim公司，现该公司被罗氏公司收购，罗氏LightCycler系统于1998年正式推出
-
2005年，罗氏LightCycler 480首次亮相，该系统有6个检测通道
-
2012年，罗氏推出的更小、更便宜的LightCycler 96有4个检测通道
下面我们以Light Cycler 480、Light Cycler 96为例进行说明，其中HRM（高分辨率溶解曲线）功能是Roche的一个卖点，该技术同样来源于Carl Witwer。
Light Cycler 480II
从外观看，480II体积庞大，具体原因可以从下面的介绍中得到答案：
1）温控系统：
与其他竞品显著差异的地方在于采用了Roche称之为“Therma-Base层”的热循环专利技术，位于银质样本反应槽和散热元件之间，Therma-Base层中的薄腔内壁为灯芯状毛细管结构，可有效增大接触表面积，里面充满液体，目的如下：
为什么480II要“多此一举”呢？
因为在早期，样本热反应槽的加热模式存在着一定程度的温度不均一性，孔与孔间相差0.4-1℃，尤其是边缘部分，这种现象称之为边缘效应；这种差异会影响到定量结果，因为不同区域内PCR反应时的温度不一样，因此有必要采取相应的措施来校正补偿。
所以ABI QS3/QS5采用VeriFlex分区的方式（3分区或6分区），Bio-Rad的CFX 系列采用蜂巢式质量减轻的反应模块。
96孔板的温度不均一性
显然480II这种技术路线可提高热循环模块的温度均一性，再加上贵金属可提高升降温速度，但缺点也很明显：设计结构复杂，成本昂贵，一旦损坏维修成本高。
2）光学系统：强光源氙气灯+五棱镜+冷CCD等
Roche在这块也花了很多心思，利用优化的光学检测元件（液态光导元件，光通路元件, 滤光片和冷CCD光通路元件）将激发光源通过液态光导元件后变成均一的适合微孔板形状检测的光。
按Roche自己的话说：采用了精心设计的五角棱镜光学结构，光学元件及焦距的巧妙组合确保了整板信号激发的特异性与数据收集的一致性，从而消除了边缘效应。
具体而言，光路通过一系列五棱镜进行复杂的折射，通过延长光路来纠正部分位置偏差，换句话就是：增加光的路程，使光程差减少到可以忽略不计的程度。
由于光路增加，所以需要强光源氙气灯提供强劲的激发光。
虽然荧光信号一般强于生物发光，但非特异性荧光产生的背景噪声使其信噪比降低，需要高灵敏度的冷CCD相机才能灵敏的检测到多次折射的荧光信号，所以又多了一个冷却装置。
所以这就是为什么480II看起来体积很大的重要原因，虽然问题解决了，但复杂的光学折射系统导致光学系统过于精密，设备成本高，运行成本较高，一旦损坏维修成本高。
另外一个需要注意的是检测通道数量：尽管LightCycler 480Ⅱ宣称具有6个检测通道，但在多重定量模式下，由于FRET探针的上游供体荧光基团Flourescin需占用FAM标记探针激发通道，同时Flourescin发射光谱 (515-530nm) 与VIC/HEX/CAL Fluor Gold 540/Cal Fluor Orange 560/TET等第二个常用荧光通道激发光谱（515-535 nm） 重叠，势必会削弱FRET探针中Donor激发能量，因而须关闭VIC/HEX荧光通道。
可见，因为荧光激发通道、检测通道工作光谱间的严重重叠干扰，LightCycler 480系列最多只能进行4重定量检测。
还有一点笔者不太理解，为什么这么一款高端qPCR仪不具备其他厂家常见的温度梯度功能呢？
Light Cycler 96
