三代数据解读
三代测序又被称为单分子实时DNA测序，采取纳米孔的单分子读取技术，相较之前测序技术，其优势为：读长长（20 Kb文库通常平均长度能达到8 Kb以上，如果DNA提取质量很高平均长度可以达到10 Kb以上），最长读长可以达到40 Kb~70 Kb左右；无需进行PCR扩增，避免reads复制比例（二代文库通常会出现复制比例偏高，覆盖度不均匀的情况）；避免GC偏好性，高GC区域可以轻松测出来，对于那些高GC或低GC物种保证从头组装基因组的可靠性。
好了废话不多说，进入今天主题.
一.数据下机结果评估
1) RSII数据下机后会有一个质控报告，小编作为一个分析人员，比较关注的点有1、SMRT Cells测了几个cell；2、Mean Read Length的平均长度，长度过短可以说明这个文库构建失败了；3、Post-Filter后的数据量，这里Pre-Filter是没有进行任何处理的原始下机数据统计，Post-Filter是对原始数据进行过滤低质量和长度小于500 bp后的数据统计（官方标准）；最后一个就是reads的分布情况。示意图如下：
还需要注意的就是下面这张图，ZMW Loading For Productivity 1里面测的数据才是可用，但是理论上来讲P0~P2的比例为1:1:1(P0代表ZMW小孔中没有DNA掉落进去，P1只有一条进入，P2就是有多条以上)，但是为了保证数据产出P1比例会高一些。
2）PacBio的新机器Sequel的数据下机暂时没有报告生成，需要拿到Subreads数据后自行进行处理统计。下面的这个表作为最初的一个参考，Total Bases产出数据量，Polymerase酶读长，以及P1的比例。
二. 数据形式
1）RSII数据是以*.h5，文件的格式进行存储，它是一个二进制的文件，通常情况是不太容易看的，所以通过软件对其进行处理成我们通常使用的FASTQ和FASTA格式。每一个cell都有对应的名字，点进去看到一些文件（信息统计结果）和一个Analysis_Results的文件夹（数据的藏身之所），这里小编借用别的小伙伴的图片更加直观展示。其中的subreads.fast*的数据是已经处理过了，可以将这三个直接合并到一起，用于分析。
2）说完RSII那么Sequel的数据是一个怎样形式呢，这里Sequel平台一个cell的数据产出大约是RSII的4~5倍，面对这么大的数据量没有继续使用h5文件进行存储，直接采用的bam文件，它的文件目录与RSII区别还是非常大，不多说了直接上图。其中的adapters.fasta是接头序列，subreads.bam这个文件是已经去除测序接头后的数据，通过一些工具给它转化成fastq或fasta即可用于后面的分析，Xml文件是对其统计信息，transferdone是告诉人们我的这个cell成功测完了。
三.小结
Sequel产出的数据量在5Gb左右，是RSII的4倍左右，价格也相对便宜很多。不久将来PacBio公司会推出更加高通量的仪器，非常期待那个时候的下机数据会与RSII和Sequl有什么不同。
整理自百迈客公众号，有删改。
