1059例回顾性调查：扩展性全外显子分析可以提高罕见病诊断率

背景介绍

二代测序显著提高了罕见遗传疾病患者的临床诊断和新基因的发现，特别是应用全外显子测序以后。但是，仍然有很多患者即使使用全外显子检测仍然得不到确诊，虽然说这一部分归结于非遗传因素或者是归因于检测未覆盖区域，但是我们相信有一部分原因是因为对基因数据没有进行彻底的全面的分析，目前常规的分析只包括分析全外显子测序中的点突变与小的插入与缺失（indel）。

除了核基因组编码区的点突变与indel可以导致遗传病以外，非编码区变异、结构变异以及线粒体基因组变异同样可以引起遗传病。最近的研究发现对全外显子进行扩展性分析可以提高诊断率， 这些扩展性分析包括拷贝数变异（CNV）分析、断裂点检测、线粒体DNA分析（通过off –target reads）、非经典剪切位点分析、以及纯合子区域分析 。以上这些扩展性分析还没有在实际的临床诊断条件下证明有多大的提高，本研究在1059例临床案例中统计这些扩展性分析可以带来多大的性能提升。

在1059例临床病例中，通过常规的全外显子分析，有402例（38%）得到确诊，而经过扩展性全外显子分析额外有44例（4.2%）得到了确诊，从而使整体确诊率提高到42.2%。每一种扩展性分析获得的确诊病例比例见figure1。

通过CNV分析有19例得到确诊，CNV分析的准确性取决于目标捕获的方法、测序深度以及样本DNA的质量。通过分析，得到的重复变异是缺失变异的2倍，CNV平均长度为442KB，在所有发现的致病CNV中，包括结构变异2例、微缺失与微重复8例，基因内缺失9例。以上这些CNV变异都能够解释患者的临床表型，并且这些变异候选经过芯片、MLPA及定量PCR的验证。

通过断裂点分析有4例得到确诊，包括怀疑为Von Hippel–Lindau综合征的VHL基因上游缺失，自闭症患者的UPF3B基因内缺失以及地中海贫血患者的HBB基因缺失。需说明的是这些缺失因为太小，用前面的CNV算法会遗漏该变异。

通过线粒体DNA分析有三例患者得到了确诊，包括一例纯合变异与两例嵌合变异，这些样本在mtDNA上的平均测序深度为51.7X，但是有21.2%的样本平均深度低于15X。（游侠补充：常规全外显子捕获是不包括线粒体DNA的，之所以在mtDNA有覆盖可能是序列同源性等原因）。另外来源于肌肉组织的样本其mtDNA测序深度要明显高于来源血液的样本。

经典剪切位点是位于内含子与外显子交界处的± 1 与 ±2，通过对非经典剪切位点分析（通过dbscSNV数据库）有13例得到了确诊，有意思的是这些非经典位点大部分（63.6%）位于+4或+5位，其他位置还包括-3，-12及两个同义突变。