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在本文中，作者描述了用于治疗阿尔茨海默病的γ-分泌酶调节剂（GSM）临床候选PF-06648671（22）的设计和合成。该设计的一个关键组成部分涉及2,5-顺式-四氢呋喃（THF）接头，以赋予构象刚性并将化合物锁定为假定的生物活性构象。这项工作是使用药效团模型指导的，因为在这项工作时没有膜结合的γ-分泌酶蛋白复合物的晶体学信息。PF-06648671实现了全细胞体外效力的出色对齐（Aβ42 IC50=9.8nM）和吸收、分布、代谢和排泄（ADME）参数。这导致临床前物种具有良好的体内药代动力学（PK）特征，并且PF-06648671实现了适合每天一次给药的人类PK特征。此外，发现PF-06648671在啮齿动物中具有良好的大脑可用性，这转化为在人类中极好的中央暴露和脑脊液（CSF）中淀粉样蛋白β（Aβ42）的强烈减少。
阿尔茨海默病（AD）是一种毁灭性的神经退行性疾病，其特征是记忆力和活动能力进行性丧失，日常生活活动困难增加，最终致命。据估计，美国目前有680万人患有AD，预计到2050年，这一数字将增加到1380万。鉴于乙酰胆碱酯酶抑制剂和NMDA受体拮抗剂等可用药物仅治疗疾病的症状，而不是提供对潜在疾病进展的有意义改变，这代表了一个巨大的未满足的医疗需求。此外，AD给医疗保健系统带来了巨大的财务负担，仅在美国，2023年估计就有3450亿美元用于与痴呆相关的治疗和护理。如果没有找到有效的疾病缓解治疗方法，预计到2050年，这一数字将增加到1万亿美元。AD的潜在病理特征是由聚集的淀粉样蛋白β（Aβ）肽组成的淀粉样斑块逐渐积累，其中42个氨基酸的肽Aβ42特别具有神经毒性，容易聚集。高磷酸化Tau蛋白的神经原纤维缠结的存在代表了另一个病理标志。Aβ肽是通过β-分泌酶（BACE）和γ-分泌酶连续切割淀粉样蛋白前体蛋白（APP）形成的。淀粉样蛋白假说假设Aβ肽（尤其是Aβ42）的积累、聚集和沉积是该疾病的核心。因此，许多组织都在寻求旨在开发BACE和γ-分泌酶抑制剂或调节剂的计划。γ-分泌酶是一种膜内裂解天冬氨酰蛋白酶，至少包含四个亚基：含有催化位点的早老素（PS1或PS2）、早老素增强子2（Pen-2）、尼卡斯特林（NCT）和咽前缺陷1（Aph-1）。最近通过冷冻电子显微镜阐明了γ-分泌酶复合物的结构，揭示了复合物的19个跨膜结构域（TMD）的拓扑结构，以及位于凹侧的nicasttrin细胞外胞外结构域的存在。靶向γ-分泌酶的初步努力导致强效抑制剂（GSI）已进入临床开发。不幸的是，由于包括认知能力下降和皮肤癌发生率增加在内的不良事件，GSI avagacestat 和semegacestat的临床试验分别在II期和III期终止。这可能归因于γ-分泌酶具有多种底物的事实。这些包括Notch受体，它在细胞分化（包括神经元发育）中起重要作用。此外，抑制γ-分泌酶可能导致C99肽（APP的BACE裂解产物）的积累，这在一些研究中已被证明对认知有不利影响。与GSI不同，γ-分泌酶调节剂（GSM）不抑制酶切割，而是变构结合以刺激底物的逐步蛋白水解裂解，导致较长、易聚集的肽（即Aβ42）的水平降低，而较短、更易溶的肽（即Aβ38和Aβ37）的水平升高。值得注意的是，Aβ的总体水平在GSM处理下保持不变。这与BACE抑制剂和GSI相反，它们分别抑制APP和APP-CTF（以及多种其他底物）的切割，从而减少所有形式的Aβ肽的产生。重要的是，APP和早老素基因中的大多数早发性家族性AD突变增加了较长的Aβ肽（Aβ42+43）与较短的Aβ肽（Aβ37+38+40）的比率，GSM变构调节γ-分泌酶以逆转该比率以纠正致病性分子表型。除了发病年龄较早外，家族性阿尔茨海默病（FAD）的病理生理学与更普遍的散发性迟发性疾病非常相似，它们被认为代表了同一疾病的谱系。因此，如果在疾病进展的适当阶段给药，GSM可能被证明对家族性阿尔茨海默病（FAD）和散发性阿尔茨海默病（SAD）均有效。值得注意的是，最近的一份报告发现，高Aβ38水平与较少的认知能力下降和转化为AD有关，这支持γ-分泌酶调节作为治疗AD的一种有吸引力的治疗策略。此外，最近研究表明，作为评估γ-分泌酶活性和脑Aβ积累的一种手段，Aβ37/42比率优于经典的Aβ42/40比率，这可能为AD和GSM治疗提供更敏感的生物标志物。通过可点击光亲和探针的设计和合成，作者已经证明GSM与PS1-NTF上的变构位点结合，该位点与GSI的结合位点不同。此外，GSM不会抑制Notch信号，因此可能缺乏与GSI相关的安全责任。因此，GSM已成为一种有前途的AD治疗方法，并在整个制药行业得到积极追求。然而，事实证明，鉴定将强大的体内功效与良好的安全性相结合的GSM极具挑战性。在对专利文献的综合分析中，作者发现：大多数GSM往往具有高亲脂性，这可能归因于γ-分泌酶作为膜内蛋白酶的性质。鉴于高亲脂性与脱靶活性增加和遇到体内毒性的可能性更大有关，这是一个令人担忧的问题。虽然识别GSM的早期工作集中在源自非甾体抗炎药（NSAIDS）的亲脂性酸上，但该领域逐渐转向各种杂芳基系列，如临床候选化学型1、2、3、4、5和6(图1）。不幸的是，由于药用特性和/或安全性不足，GSMs 1-4的进一步开发已停止，从而强调了将该靶点的有效性与安全性相结合的困难。罗氏最近披露了GSM RG6289的I期试验结果，显示脑脊液中Aβ42和Aβ40水平降低，同时Aβ37和Aβ38同时升高。图1.来自卫材、BMS、NeuroGenetics/TorreyPines Therapeutics和Acta Pharmaceuticals的杂芳基GSM临床候选药物，以及来自罗氏的临床候选化学型作者之前报道过吡哆嗪-1,6-二酮系列的设计，以8为例（图2）。通过战略性掺入氟，确定了9，它在改进的物理化学性质空间内实现了出色的效力，并具有良好的ADME谱。在此，作者描述了一种优化初始吡啶酮GSM导联8的替代方法。这项工作的核心是构象限制性接头的设计，以锁定8的柔性侧链，以采用假定的生物活性构象。所得的化学型10具有优异的体内疗效，并最终导致鉴定出Pfizer GSM临床候选药物PF-06648671（22）。I期临床试验于2015年启动，给药14天后，健康志愿者的脑脊液中Aβ42最大降低65%。
图2.吡哆嗪-1,6-二酮GSM的设计
导致9的设计策略侧重于识别氧化代谢倾向降低（即提高亲脂性代谢效率LipMetE）的亲脂性芳基取代基，调整效力和代谢稳定性，同时避免P-gp介导的外排。作者还寻求了一种替代方法，即通过引入构象限制性接头将分子锁定在假定的生物活性构象中，从而产生10等化合物，从而提高效力（图2）。在这项工作进行时，没有可用的结构信息指导这种具有挑战性的膜结合天冬氨酰蛋白酶的调节剂设计。然而，作者从文献报告和内部工作中获得了大量结构-活性关系（SAR）数据，这些数据表明了特定的结合位点要求。构象限制性化合物的数据特别具有指导意义，使我们能够构建药效团模型来帮助指导设计。吡哆嗪-1,6-二酮核心的刚度明确定义了结合位点的两个中央受体特征的择优取向。对文献SAR的检查提供了有关甲基咪唑部分的优选方向和8的2-三氟甲基-4-氯苯基取代基可能投射的亲脂性口袋的方向性的进一步线索。以这些信息为基础，由化合物8的低能构象构建了一个药效团模型，这与作者对GSM活性位点SAR的了解一致。为了保持跨多个GSM化学型的简单性和普遍适用性，该模型仅限于三个供体位点特征和一个疏水特征。图3显示了映射到化合物8上的最终药效团模型。同时图3还表明，化合物8的乙醚接头采用弯曲构象将芳基取代基引导至疏水特征。这与8的构象分析结果形成鲜明对比，后者表明乙醚系绳的线性构象在能量上是首选。这些观察结果将作者的工作指向设计具有约束接头的类似物，这些接头可以采用假定的结合构象。图3.与化合物8重叠的GSM药效团模型的两个视图。蓝色球体表示极性相互作用的方向性，而绿色球体表示亲脂性末端芳香环的首选位置。该图说明了乙醚接头采用的弯曲构象，将疏水尾件定向到模型上
作者的主要设计目标是提高效力并最终降低未结合的有效血浆浓度（CEFF,U,P）和预计的人体剂量，同时保持良好的安全性和药代动力学（PK）特征。为此，作者使用药效团模型并结合经典药物化学设计和计算机技术来组装一系列可能可能加强必要侧链扭曲的连接子。掺入氢键供体（HBD）的连接子被明确排除在外，因为众所周知，增加氢键供体的数量通常倾向于增加P-gp介导的外排倾向。对化合物进行计数、最小化并停靠在药效团模型中。然后根据结构考虑和物理化学性质评估得分最高的化合物。从这个练习中，该团队选择了一组用于合成的类似物，其中1,3-顺式-环己基连接的类似物11成为最有效的先导化合物（表1）。该化合物具有Aβ42 IC50的98nM作为外消旋体，并作为进一步优化的有希望的起点。图4描述了叠加在药效团模型上的11能量最小化结构，突出了1,3-顺式-环己基接头增强所需构象的能力。图4.化合物11叠加在GSM药效团模型上。蓝色球体表示极性相互作用的方向性，而绿色球体表示亲脂性末端芳香环的首选位置
虽然化合物11具有很强的亲脂性（cLogP=4.0），但环己基接头提供了引入杂原子以生成极性增加的杂环烷基环系统的机会。尽管相应的四氢吡喃接头本来是下一个合乎逻辑的步骤，但作者还是选择了相应的2,5-顺式-四氢呋喃（THF），因为他们的化合物文件中很容易找到合适的构建单元。此外，这些化合物在药效团模型中显示出良好的叠加，并将进一步改善该系列的物理化学性质。与模型一致（见图5），2,5-顺式-THF接头提供了有效的化合物（即12，Aβ42 IC50=28nM，单个对映异构体），而相应的2,5-反式THF接头活性显著降低（13，Aβ42 IC50=235nM，表1）。化合物12在人肝微粒体中表现出更高的稳定性同时保持较低的MDR流出比（使用MDR1/MDCK测定法测定，该测定法利用转染编码人P-糖蛋白的基因的MDCK细胞）。对末端芳基环的SAR的评估表明，对位的取代很重要，因为将三氟甲基移动到正位或元位会导致效力降低（化合物14和15）。图5.顺式THF12（绿色）和反式THF13（紫色）在GSM药效团模型上的叠加。蓝色球体表示极性相互作用的方向性，而绿色球体表示亲脂性末端芳香环的首选位置
对于诸如9的化合物，之前已经确定，可以通过在与内酰胺氮相邻的亚甲基上引入手性甲基来提高效力。作者设想在THF系列中可能会使用相同的设计策略，以进一步加强假定的生物活性构象并提高12的效力。因此，在使用药效团模型（vide infra）的良好建模结果的支持下，他们开始合成甲基取代的THF类似物16。这种结构修饰在体外提供了额外的2倍效力提升（Aβ42 IC50=14nM），尽管以降低代谢稳定性为代价。尽管如此，使用大鼠时程实验选择化合物16进行体内广泛分析，然后进行药代动力学/药效学（PK/PD）建模，以确定实现Aβ42降低25%所需的平均未结合脑浓度（脑Aβ42 IC25)。令人欣慰的是，16在体内被证明具有高效性，并且具有大脑Aβ42 IC2519nM未结合脑浓度的值，体外/体内相关性为：与更灵活的醚连接系列（如8）中的化合物相比，16效果更好。此外，16在患者中表现出良好的大脑渗透性，且Cb,u/CP,U大鼠的（大脑可用性）值为0.5。化合物16的构象分析预测，手性甲基（S-立体异构体）将几乎完全限制侧链进入所需的构象（94%玻尔兹曼构象体群），尽管转弯比药效团模型建议的要紧密得多。这种更尖锐的转向被小分子X射线结构证实。图6显示了化合物16模型和相应X射线结构的叠加。包括化合物12与药效团模型的比对以供参考。化合物16代表了先导化合物优化工作的关键里程碑。X射线结构不仅证实了甲基-THF接头增强了所需的弯曲构象，而且化合物16的效力和整体特性相对于不受限制的初始导联8：Aβ42 IC50也得到了显著提高，从101nM提高到14nM，同时将cLogP从3.3降低到2.5并保持良好的ADME谱。图6.化合物16模型（绿松石色）和小分子X射线（橙色）的叠加图，说明了疏水侧链的紧密转弯。显示去甲基类似物化合物12（绿色），因为它与药效团对齐，以供参考
接下来，他们将注意力转向末端苯基环的优化。替代模式的性质对于进一步提高效力，同时保持良好的代谢稳定性和良好的大脑渗透性至关重要。例如，苯基环的电子密度增加导致代谢稳定性降低，如17和18（HLM CLint，app=66.6和212μL/min/mg）。另一方面，降低电子密度（如19中带有3,5-二氟-4-三氟甲基取代）导致稳定性提高（HLM CLint，app=20.5μL/min/mg）和出色的体外效力（Aβ42 IC50=3.3nM）。然而，这种化合物的脑渗透性差，Cb,u/CP,U值为0.08。这一发现是出乎意料的，因为MDR外排比表明它不是P-gp底物（MDR ER=1.4）。完成本文描述的工作后，使用来自美国国立卫生研究院（NIH）的细胞系，动态范围大于标准Borst细胞系，评估表2中的化合物由乳腺癌耐药蛋白（mBCRP）和P-gp介导的潜在外排。虽然19的脑渗透减少不能用mBCRP来解释，但NIH MDR外排测定表明，相对于表2中的其他化合物，P-gp介导的外排范围更大。值得注意的是，将氟原子从5位移动到2位导致大脑可用性的显着提高，如20（Cb,u/CP,U=0.5）。该化合物还与大鼠脑Aβ42一起表现出优异的体内疗效IC25值为12nM。
优化以进一步降低未结合的有效浓度（Ceff）最终得到21和22，它们各自在大鼠脑Aβ42的体内表现出优异的降低活性，21和22的Aβ42 IC50值分别为3.3和3.4nM。这些关键化合物还实现了良好的大鼠大脑可用性（21和22的Cb.u/CP.U值分别为0.5和0.7），这在非人灵长类动物（NHP）的脑渗透研究中得到进一步证实，其中21被发现具有Cb,u/CP,U值为1.0。鉴于21和22的分子量分别为520和539，这些化合物的高脑可用度是值得注意的。众所周知，遇到转运蛋白介导的外排的可能性随着分子量的增加而增加。然而，由于引入氟原子而增加的分子量通常不会导致遇到P-gp介导的外排的风险增加。作者便进一步建议使用氟校正分子量（MWFC），并证明这是与MDR ER相关的更相关的设计参数。22的MWFC值是463，这更接近“传统”CNS物理化学性质空间。最终，GSM 22（PF-06648671）表现出最佳的整体特征，并被选中进行体外和体内的广泛评估。如表3所示，在Notch（Notch胞内结构域，NICD）上获得了良好的选择性和hERG（分别为>1,600倍和>1,020倍）。平均而言，GSM 22比CNS药物更具亲脂性，这似乎是该特定膜内天冬氨酰蛋白酶靶标在低未结合血浆浓度下实现稳健体内疗效的要求。虽然位于理想的CNS物理化学性质空间（CNS MPO=3.81）的边缘，22取得了良好的ADME和药代动力学特征。例如，它具有中等被动磁导率（RRCK=5.8×10–6cm/s），并且它不是P-gp介导的外排（MDR ER=2.1）的底物。使用充分搅拌的模型缩放人肝微粒体和肝细胞中的内在表观清除率表明，预计人血浆清除率可能较低（HLM CLp=3.0mL/min/kg和HHEP CLp=1.0mL/min/kg）。评估化合物22对细胞色素p450酶的可逆抑制，并且在治疗相关浓度下未表现出显着抑制。
在大鼠和狗中评估了22的体内药代动力学特征（表4）。与体外数据一致，22表现出低全身清除率和低分布容积。观察到的口服生物利用度良好，大鼠和狗的值分别为67%和88%。如前所述，在Cb,u/CP,U大脑可用性为0.7。体外和体内ADME和PK数据能够预测人类PK参数，并且有利的预测概况（表4）支持进一步发展。表4.PF-06648671的药代动力学特征（22）
在大鼠研究中确定了体内疗效。GSM 22以10和40mg/kg口服给药，并在1、4、8、11、16和20小时时间点测量大脑中Aβ42的减少以及相应的化合物暴露（图7）。实现了脑Aβ42的稳健和持续降低，在40mg/kg剂量后的8小时时间点最大降低64%。总之，化合物22在体内被证明具有高效性，具有未结合的大鼠脑Aβ42 IC25=3.4nM且未结合的大鼠脑Aβ42 IC50=11.9nM 。图7.GSM 22的大鼠体内疗效数据
在狗研究中进一步检查了GSM 22的体内概况。如图8所示，口服剂量为20mg/kg GSM 22可有效且持续地降低CSF中的Aβ42和Aβ40（Aβ 42和Aβ40的最大减少分别为50%和56%）。根据GSM的明确表征机制特征，较长肽Aβ42和Aβ40的减少伴随着较短的、潜在的神经保护肽Aβ38和Aβ37的增加，而总Aβ保持不变。应该注意的是，这种特征与γ-分泌酶抑制剂的特征形成鲜明对比，后者可减少所有形式的Aβ肽。图8.GSM 22的狗体内疗效数据（20 mg/kg PO）
在本文中，作者描述了一系列新型γ-分泌酶调节剂的设计和合成，其中包含一个2,5-顺式-THF接头，该接头赋予构象刚性，以有效地将分子偏置成假定的药理活性构象。这种设计是通过构建GSM药效团模型实现的，该模型映射了结合位点中关键极性相互作用相对于亲脂性口袋的优选方向，而亲脂性口袋又与杂芳基型GSM的末端芳香环相互作用。在THF接头上引入手性甲基进一步增强了必要的构象，16的单晶X射线分析表明，该分子确实采用弯曲构象作为低能状态，符合设计目标。随后对末端芳香环取代模式的调节得到PF-06648671（22），该化合物实现了效力、选择性和ADME特性的综合，尽管根据3T3的阳性测试发现，该化合物具有潜在的光毒性风险。然而，在大鼠时程研究中却发现该化合物具有优异的体内疗效，并利用PK/PD建模测得，未结合的大鼠脑Aβ42 IC50为11.9nM。大鼠和狗的体外ADME特性以及体内药代动力学特征表明，该化合物预期具有有利的人类PK参数以及出色的脑渗透性，支持每天一次的给药频率。此外，GSM 22在大鼠和狗的4周GLP毒理学研究中进行了评估，表明良好的安全性特征支持22进入临床开发。GSM 22已进入I期临床研究，结果此前已发表。在2-360mg剂量的单次递增剂量研究中观察到快速吸收和~20h的血浆半衰期。化合物22随后在一项为期14天的多次递增剂量研究中以4-360毫克的剂量进行评估，并在所有剂量下表现出良好的安全性。CSF中的化合物浓度证实了CSF对~1的未结合血浆浓度具有出色的脑渗透性。在人CSF中实现了Aβ42和Aβ40的稳健和剂量依赖性降低，PK/PD模型表明在75mg剂量q.d时Aβ42最大减少50%。Aβ42的减少程度大于Aβ40，并且根据在临床前物种中观察到的GSM的一般概况，Aβ42和Aβ40的减少伴随着较短肽Aβ37和Aβ38的增加，其中Aβ37的增加最大。在任何剂量下，总Aβ水平与基线相比均无统计学变化。这些结果进一步支持GSM能够将Aβ谱从较长的聚集倾向肽转移到较短、更良性的Aβ肽。需要强调的是，GSM引起的Aβ谱改变与GSI和BACE抑制剂不同，后者会减少所有形式的Aβ肽。最近涉及几种抗Aβ抗体的临床数据表明，在早期阿尔茨海默病中去除淀粉样蛋白斑块可以减缓疾病进展。虽然Aβ免疫疗法侧重于清除现有的Aβ，但它们并不能解决Aβ的异常产生。GSM治疗为减少易聚集的Aβ肽的产生提供了一个令人兴奋的机会，从而防止新斑块的形成。这种方法有望用于阿尔茨海默病的一级预防和/或作为抗Aβ抗体清除淀粉样蛋白后的维持治疗。 J. Med. Chem. 2024, 67, 10248−10262
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