近年来，癌症免疫治疗作为一种新兴的治疗手段，通过激活患者自身的免疫系统来攻击癌细胞，展现出了巨大的潜力。然而，目前的免疫治疗方法，如免疫检查点抑制剂和CAR-T细胞疗法，仍面临一些挑战，如免疫抑制微环境、治疗成本高昂以及对某些类型癌症的疗效有限等。
在疫苗领域，mRNA疫苗在COVID-19大流行期间大放异彩，证明了其在疾病预防和治疗中的巨大潜力。然而，mRNA疫苗仍存在一些局限性，如稳定性差、免疫原性难以控制等。小型环状RNA（circRNA）疫苗作为一种新型疫苗平台，具有独特的结构和优势，有望克服mRNA疫苗的这些局限性，为癌症免疫治疗带来新的希望。
成果简介
鉴于此，
密歇根大学Guizhi Zhu等人
表明，装载在脂质纳米颗粒中的抗原编码小环状 RNA
(circRNA) 在小鼠皮下注射后可引发强效持久的 T 细胞反应，从而实现强大的肿瘤免疫治疗，尤其是与免疫检查点抑制相结合时。小环状 RNA 疫苗非常稳定，蛋白激酶 R 的激活水平低，细胞毒性低，可实现持久的抗原翻译（在细胞中超过 1 周）。相对于大型蛋白质编码的未修饰或修饰的 mRNA 和环状 RNA，小环状 RNA 疫苗在小鼠中引发高达 10 倍的抗原特异性 T 细胞，占 6个月内外周 CD8+ T 细胞总量的 30-75%。编码肿瘤相关抗原、新抗原和肿瘤病毒或病毒抗原的小环状RNA疫苗在年轻成年小鼠和免疫衰老小鼠中引发大量CD8+和CD4+T细胞反应。与免疫检查点抑制相结合，单价和多价环状RNA疫苗可降低肿瘤诱导的免疫抑制并抑制免疫原性较差的小鼠肿瘤，包括对免疫检查点阻断有抗性的黑色素瘤。
图1|小型环状RNA疫苗的示意图，展示其如何通过稳定表达抗原，激活强大的T细胞反应，用于肿瘤免疫治疗
优化和表征高度稳定的小型circRNA疫苗
研究团队通过特定的RNA连接技术，合成了包含最小元素的小型circRNA疫苗，包括优化的肽抗原编码RNA、短IRES和Kozak共识序列。以MHC-I限制性卵清蛋白（OVA）257–264（OVA257–264或SIINFEKL）为模型抗原，制备了circRNA，并通过Sanger测序和凝胶电泳等方法验证了其环化效率和序列准确性。研究发现，使用crTMV IRES的circRNA-SIINFEKL能够更有效地促进抗原呈递和T细胞激活，相较于其他类型的IRES和线性RNA（liRNA），其在细胞内的抗原呈递和T细胞激活能力显著增强。
图2|小型环状RNA疫苗的优化和表征，包括其稳定性、抗原呈递和T细胞激活能力
LNPs
高效递送小型circRNA至淋巴结和APCs
为了选择最适合小型circRNA疫苗的纳米载体，研究团队测试了脂质体和三种LNPs，分别装载circRNA-SIINFEKL和对照5moU-mRNA-OVA。结果显示，SM-102 LNPs对circRNA和mRNA的包封效率相当，且在小鼠体内能够高效地将circRNA递送至引流淋巴结和淋巴结内的APCs，如CD8+经典树突状细胞（cDCs）和CD4+
T细胞诱导的cDCs等，从而有效激活T细胞免疫反应。
图3|脂质纳米颗粒（LNPs）高效递送小型环状RNA至淋巴结和抗原呈递细胞（APCs），以激活T细胞反应
小型circRNA介导的免疫调节与低PKR激活
通过对小鼠骨髓来源的树突状细胞（BMDCs）进行RNA-seq分析，研究团队发现小型circRNA疫苗相较于空白LNPs，能够激活一系列模式识别受体（PRRs），如RIG-I，从而提供内在的免疫刺激。同时，小型circRNA疫苗对PKR的激活水平低，细胞毒性小，具有良好的安全性。这可能是由于小型circRNA缺乏长双链RNA结构，从而减少了对PKR的激活。
图4|小型环状RNA疫苗激活模式识别受体（PRRs）进行内在免疫刺激，并表现出低蛋白激酶R（PKR）激活
小型circRNA疫苗与改良mRNA、大circRNA和未修饰mRNA疫苗的对比
在体外和体内实验中，研究团队将小型circRNA疫苗与多种改良mRNA疫苗和大circRNA疫苗进行了对比。结果显示，小型circRNA疫苗在激活抗原呈递和T细胞免疫反应方面优于或至少与这些疫苗相当。在小鼠模型中，小型circRNA疫苗能够诱导更强和更持久的T细胞免疫反应，且在免疫衰老的老年小鼠中也表现出良好的免疫效果。
图5|小型环状RNA疫苗与多种改良mRNA和大型环状RNA疫苗相比，展现出更强和更持久的T细胞反应
小型circRNA疫苗对多种肽抗原的广泛适用性
小型circRNA疫苗可编码多种肽段抗原，包括MHC-I限制性和MHC-II限制性抗原，从而分别激活CD8+和CD4+ T细胞。在小鼠模型中，小型circRNA疫苗能够显著抑制肿瘤生长，包括对ICB耐药的黑色素瘤。此外，小型circRNA疫苗还能够提高T细胞对肿瘤的浸润能力，改变肿瘤免疫微环境，从而增强抗肿瘤免疫效果。
图6|小型环状RNA疫苗对多种肽抗原的广泛适用性，包括肿瘤相关抗原和病毒抗原
图7|小型环状RNA疫苗在肿瘤免疫治疗中的应用，通过减少肿瘤免疫抑制，增强抗肿瘤免疫细胞的浸润
图8|小型环状RNA疫苗在多种肿瘤模型中的联合免疫治疗效果，包括对免疫检查点阻断剂耐药的黑色素瘤
