【高分综述 056】肿瘤突变负荷临床应用、挑战与新兴进展

• 肿瘤突变负荷（TMB）是指肿瘤基因组中体细胞非同义突变的总数，其在不同癌症类型中存在差异。

• TMB作为免疫检查点抑制剂疗效的预测生物标志物，已在多项研究中得到验证，并促成了相关药物的批准。

• 研究正致力于提高TMB评估的准确性，减少实验室过程中的混杂因素，并探索将TMB与其他生物标志物结合的可能性。

• 深入理解TMB及其在肿瘤免疫应答中的作用对于肿瘤学领域具有重要意义。

免疫肿瘤学中的生物标志物

• TMB作为免疫肿瘤学中的预测生物标志物，其理论基础建立在对肿瘤细胞基因组变异的深入理解之上。

• TMB的计算基于对肿瘤细胞基因组中非同义突变的量化，这些突变可能改变蛋白质的氨基酸序列，从而产生新的或改变的抗原。

• 肿瘤细胞中的突变负荷反映了其基因组的不稳定性，这种不稳定性可能由多种生物学过程引起，包括错配修复缺陷、聚合酶错误、烟草烟雾暴露、紫外线照射等。

• TMB的高值通常与肿瘤细胞能够呈现给免疫系统的新抗原数量较多有关，这增加了免疫治疗成功的可能性。

• TMB的概念在癌症基因组学和DNA测序的几十年研究中逐渐形成，并在2013年首批大规模癌症测序项目完成后获得了显著的关注。

• 这些研究结果表明，TMB较高的肿瘤患者更可能从免疫治疗中获益，因为它们有更高的概率至少表达一种高度免疫原性的新抗原，从而触发免疫系统对肿瘤的攻击。

图1. TMB对肿瘤特异性免疫反应影响的简化表示。

a, 肿瘤突变负荷（TMB），定义为肿瘤基因组中存在的突变数量，是不同促进突变积累的过程的结果，这些过程在不同的时间跨度上发生。与这些过程相关的不同突变率决定了高TMB表型的可能性。校对缺陷（PRD）和错配修复缺陷（MMRd）机制的缺陷很可能导致高或超高TMB，而与APOBEC激活或自发脱氨作用相关的突变过程则不太可能如此。

b, 树突细胞的抗原摄取。肿瘤衍生的突变蛋白被专业的抗原呈递细胞（APC），如树突细胞内化，并经历细胞内处理，导致抗原肽的生成。对细胞毒性（CD8+）T细胞的呈递至关重要的新肽（这些细胞对T细胞介导的抗肿瘤免疫至关重要）被装载到MHC I类分子上，而那些打算呈递给辅助（CD4+）T细胞的则被装载到MHC II类分子上。

c, CD8+ T细胞的启动。迁移到淋巴结后，树突细胞将处理过的肿瘤衍生新肽在MHC I分子上呈递给原始的CD8+ T细胞（以灰色表示）。通过T细胞受体（TCR）识别这些抗原-MHC I复合物是T细胞激活的先决条件。CD28与CD80/CD86的相互作用提供的共刺激信号也是这种激活所必需的。被启动的T细胞经历克隆扩增并分化成具有特定功能的效应T细胞，包括细胞毒性T细胞。这一过程受到CTLA4的负向调节，CTLA4与CD80/CD86以拮抗性方式结合CD28，促进免疫耐受。

d, CD8+ T细胞的细胞毒性活性。激活的CD8+ T细胞识别肿瘤细胞表面由MHC I呈递的肿瘤相关新肽。这种相互作用触发细胞毒性分子如穿孔素和颗粒酶的释放。癌细胞也可能表达PD-L1，它与CD8+ T细胞上的PD-1相互作用，导致T细胞活性的抑制。CTLA4结合CD80/CD86以及PD-L1结合PD-1激活的下游信号通路使肿瘤能够逃避免疫监视。具有高TMB的癌细胞可能产生更多的新肽（部分a），因此更有可能成功地进行抗原摄取、处理和呈递（部分b和c），以及被成熟的（CD8+）T细胞（部分d）识别的可能性增加。

理论背景

• 肿瘤突变负荷（TMB）作为免疫肿瘤学中的一个关键生物标志物，其定义为肿瘤基因组中存在的体细胞非同义突变的总数，这一概念在癌症基因组学和DNA测序的几十年研究中逐渐形成。

• TMB的测量提供了一种量化癌症基因组与其正常对应基因组偏差的方法，这种偏差通过体细胞突变的累积来体现，其中包括了在癌症发展过程中积累的各种基因组改变。

• 这些基因组改变可能包括驱动癌症恶性转化的关键基因突变，以及可能被免疫系统识别为非自身成分的肿瘤特异性抗原。

• TMB的高值通常意味着肿瘤细胞携带更多的新抗原，这些新抗原有可能被免疫系统识别，从而触发对肿瘤的免疫反应。

• TMB的概念在2013年首批大规模癌症测序项目完成后获得了显著的关注，这些研究揭示了不同类型癌症之间TMB的显著差异，以及TMB与免疫治疗反应之间的相关性。

• 早期的开创性研究，如对接受抗CTLA4抗体治疗的晚期黑色素瘤患者和接受抗PD-1抗体治疗的晚期非小细胞肺癌（NSCLC）患者的研究，证明了TMB作为预测免疫治疗反应的生物标志物的潜力。

• 这些研究结果表明，TMB较高的肿瘤患者更可能从免疫治疗中获益，因为它们有更高的概率至少表达一种高度免疫原性的新抗原，从而触发免疫系统对肿瘤的攻击。

• 随着对TMB在不同癌症类型中作为预测免疫治疗反应的生物标志物的进一步研究，人们开始探索将TMB与其他生物标志物结合的可能性，以提高预测的准确性和临床应用价值。

• 这些研究结果不仅加深了我们对TMB作为预测免疫治疗反应的生物标志物的理解，而且为开发新的治疗策略和个体化医疗提供了重要的科学依据。

图2. 泛癌种错义突变和插入/缺失（indel）负荷分析。这项分析是使用公开可用的癌症基因组图谱队列168数据进行的。垂直线标出了199个错义突变的截止值，该值在使用全外显子组测序数据分析时，区分了TMB高和TMB低的肿瘤。

a, 按癌症类型分类的错义突变和indel负荷。

b, 按DNA修复缺陷类型分类的肿瘤。错配修复缺陷（MMRd）是通过分析至少有100个错义突变的肿瘤中信号突变C(C > A)N、G(C > T)N和Y(A > G)N的比例来识别的，如其他地方详细描述的169。校对缺陷（PRD）是通过检测POLE或POLD1中的有害突变来确定的。同源重组修复缺陷（HRD）是基于至少42的HRDsum评分来确定的。

COAD/READ，结直肠腺癌；LUAD，肺腺癌；LUSC，肺鳞状细胞癌；SKCM，皮肤黑色素瘤；STAD，胃腺癌；UCEC，子宫体子宫内膜癌。

测量和混杂因素

• TMB的测量是通过对肿瘤样本进行全外显子组测序（WES）或使用靶向基因面板测序来实现的，这些方法能够揭示肿瘤细胞中的突变谱。

• WES提供了对肿瘤样本中所有编码区域的全面分析，而靶向面板测序则侧重于特定基因集，这可能限制了对肿瘤突变全貌的了解。

• 在仅使用肿瘤组织进行测序的情况下，需要通过单核苷酸多态性（SNP）数据库和生物信息学算法来过滤掉来自正常细胞的突变，而不是依赖于与非恶性样本的比较。

• TMB的测量受到多种因素的影响，包括技术变异、样本的肿瘤纯度、样本处理和存储条件，以及用于突变检测的生物信息学工具和算法。

• 肿瘤纯度对TMB的测量至关重要，因为非肿瘤细胞的存在会稀释突变等位基因的频率，从而影响突变的检测和TMB的计算。低纯度样本可能导致TMB被低估，从而影响患者分层和治疗决策。

• 为了确保TMB测量的准确性，需要对实验室流程和生物信息学分析进行严格的质量控制，包括对突变检测算法的敏感性和特异性进行优化。

• 研究正在探索如何通过改进TMB的测量方法来减少技术变异和其他混杂因素的影响，以提高TMB作为预测免疫治疗反应的生物标志物的可靠性。

• 混杂因素的识别和控制对于提高TMB测量的准确性至关重要，这包括对实验室操作、样本处理、测序深度和数据分析方法的标准化。

• 未来的研究可能会集中在开发新的生物信息学工具和算法，以提高对肿瘤突变的检测能力，减少由于技术限制和样本质量差异导致的测量误差。

图3. 肿瘤纯度对TMB测量的影响。使用公开可用的癌症基因组图谱（TCGA）亚组数据（肿瘤纯度≥80%和基因分型可用的拷贝数数据，n=4,900）168进行不同纯度水平的肿瘤纯度模拟。我们模拟了纯度从10%到80%的均匀肿瘤纯度队列。将10-70%的肿瘤纯度与作为参考的80%肿瘤纯度进行比较。模拟纯度为q的肿瘤的肿瘤突变负荷（TMB）计算为具有变体等位基因频率（VAF）纯度=q≥5%的错义突变数量，在其中，模拟肿瘤的VAF与原始肿瘤的VAF通过VAF (纯度=q) = d(p)/d(q) × VAF (纯度=p)连接，其中d(x) = 1 + 2/CN × (1/x – 1)。这里，CN是突变区域肿瘤的拷贝数。

a, 相对于参考值检测到的低纯度肿瘤的TMB（%）。箱体图表示10%，25%，50%，75%和90%的分位数。

b, 与80%参考值相比，检测TMB高（≥199个错义突变）肿瘤的敏感性。条形图表示95%置信区间。

c, 在特定癌症类型中检测TMB高肿瘤的敏感性（提供的数据是至少有10个TMB高肿瘤的实体）。

临床使用的局限性

• 尽管多项研究显示TMB与ICI的反应及TMB高表达肿瘤患者在接受ICI治疗时的改善生存结果之间存在正相关，但这些研究提供的是跨广泛TMB层次的平均结果，并且/或分析了涵盖多种不同肿瘤类型的多个研究的数据。

• TMB作为预测生物标志物的临床应用存在一定的局限性，尤其是在确定所有癌症类型和患者群体中TMB的最佳阈值方面。

• 尽管TMB高表达与免疫治疗反应之间的相关性在某些研究中得到了证实，但这种相关性并非在所有癌症类型中都得到了一致的验证，表明TMB的预测价值可能因癌症类型而异。

• TMB的临床应用还受限于其测量的复杂性，包括选择合适的生物标志物阈值、确保足够的肿瘤样本质量和纯度，以及处理可能影响TMB测量准确性的技术变异。

• 此外，TMB的预测价值可能受到肿瘤微环境中其他因素的干扰，如肿瘤免疫细胞浸润的程度、肿瘤细胞的PD-L1表达水平，以及其他可能影响免疫反应的分子和细胞机制。

• 因此，尽管TMB是一个有前景的生物标志物，但在将其作为临床决策工具之前，还需要进一步的研究来优化其测量方法、定义更精确的阈值，并探索与其他生物标志物的联合应用。

肿瘤新抗原负荷

• TMB作为预测免疫检查点抑制剂疗效的生物标志物，其背后的核心假设是肿瘤细胞中的突变可以产生新抗原，这些新抗原能够被免疫系统识别并引发抗肿瘤免疫反应。

• TNB是指肿瘤细胞中由突变产生的、能够被免疫系统识别的新抗原的总量，这一概念是对TMB的补充和深化。

• TNB的评估考虑到了TMB中包含的突变是否能够产生能够被免疫系统识别的免疫原性肽段，这涉及到突变的类型、位置以及它们在蛋白质中的表达和呈递。

• 与TMB相比，TNB的测量更为复杂，因为它不仅涉及到突变的检测，还需要预测这些突变是否能产生能够被主要组织相容性复合体（MHC）分子呈递给T细胞的免疫原性肽段。

• 为了预测哪些突变有可能产生新抗原，研究人员开发了一系列的生物信息学工具和算法，这些工具利用已知的MHC分子结合特性和肽段的结构特征来预测潜在的新抗原。

• TNB的概念强调了肿瘤免疫原性的重要性，即肿瘤细胞必须能够产生足够数量的免疫原性肽段，以激活和维持有效的抗肿瘤免疫反应。

• 研究表明，TNB与免疫治疗的疗效之间存在相关性，特别是在那些TMB高但对免疫检查点抑制剂反应不佳的肿瘤中，TNB可能提供了更精确的预测信息。

• 然而，TNB的测量和应用仍处于研究阶段，需要更多的临床数据来验证其作为预测生物标志物的准确性和实用性。

图5. 突变的免疫原性和肿瘤新抗原负荷。使用四种新抗原预测算法分析了TCGA泛癌队列数据中存在的突变，并评估了它们通过MHC I类分子呈递的情况。

a, 通过移码和非移码突变区分的结合亲和力或洗脱配体排名分数的分布。垂直线表示与HLA I类分子结合的截止值。对于NetMHC 4.0和MHCFlurry 1.2，截止值为IC50 = 500 nM。对于NetMHCPan 4.1和MHCFlurry 2.0，分析了对应于弱结合物（WBs, 0.5%）和强结合物（SBs, 2%）的两个截止值。

b, 分别对错义突变、移码突变、非移码缺失和非移码插入的突变通过MHC I类分子呈递的百分比。所呈现的数据是所有分析肿瘤的平均值和标准差。肿瘤新抗原负荷（TNB）和肿瘤突变负荷（TMB）呈中度至强相关（泛癌队列中的Spearman相关性：NetMHC 4.0: 0.67, MHCFlurry 1.2: 0.65, NetMHCPan 4.1 WB: 0.79, NetMHCPan 4.1 SB: 0.68, MHCFlurry 2.0 WB: 0.79 和 MHCFlurry 2.0 SB: 0.79）。

c, 顶部，每个癌症类型的TMB高（≥199个错义突变）和TNB高（通过最大化Youden指数将TMB截止值转移至TNB）的肿瘤百分比。误差条（最小至最大百分比）指的是六种新抗原预测方法的结果。底部，相对于所有突变呈递突变的百分比（TNB/TMB）。所呈现的数据是每种特定肿瘤类型的平均值。

TMB的改进

• TMB的改进是为了更精确地预测免疫检查点抑制剂的反应，通过考虑突变的特定特征和肿瘤微环境中的其他因素。

• TMB的改进方法是为了提高其作为免疫检查点抑制剂疗效预测生物标志物的准确性和临床实用性。

• 克隆性TMB（cTMB）： 这一概念区分了肿瘤中的克隆（或称为主干）突变和亚克隆突变。克隆突变存在于肿瘤的所有细胞中，因此可能对整个肿瘤群体产生影响，而亚克隆突变只存在于一部分细胞中。cTMB专注于那些在肿瘤发展早期获得的、可能被所有肿瘤细胞共享的突变，这些突变更有可能被免疫系统识别。

• 持续性TMB（pTMB）： 此概念进一步细化了TMB的评估，只计算那些在肿瘤进化过程中持续存在的突变。这些突变因其在肿瘤发展中的稳定性，可能对免疫治疗的反应更为关键。

• 表达性TMB（eTMB）： 这种方法考虑了突变是否在RNA水平上表达，因为只有那些被转录和翻译的突变才有可能被处理成新抗原，并呈递给免疫系统。

• 肿瘤新抗原负荷（TNB）： TNB是对TMB概念的扩展，它专注于那些能够产生免疫原性肽段的突变。这些肽段能够被MHC分子呈递，并可能引发T细胞介导的免疫反应。

• HLA校正TMB： 考虑到肿瘤细胞可能丢失特定的HLA等位基因，这可能影响突变肽段的呈递。HLA校正TMB通过考虑肿瘤细胞中存在的HLA等位基因，来预测哪些突变肽段更有可能被免疫系统识别。

• 突变特征： 这一方法分析肿瘤中的突变模式，以识别特定的突变过程，这些过程可能与肿瘤的免疫原性有关。例如，某些特定的突变特征可能与高免疫原性相关，从而影响免疫治疗的效果。

• 这些TMB的改进方法提供了更为细致的肿瘤免疫原性评估，有助于更好地理解肿瘤与免疫系统之间的相互作用，并可能提高预测免疫治疗反应的准确性。然而，这些方法的临床应用仍处于研究阶段，需要通过临床试验来验证其有效性，并确定它们在个体化治疗策略中的作用。

与其他生物标志物的结合