2025年3月20日，耶鲁大学
陈斯迪
课题组在
Nature Biomedical Engineering
杂志在线发表了文章
Cas12a knock-in mice for multiplexed genome editing, disease modelling and immune cell engineering
，
开发出多种Cas12a敲入小鼠模型，助力针对复杂基因互作网络，疾病建模与免疫遗传学的研究。
基因编辑技术的兴起，尤其是Cas9敲入小鼠的开发，显著加速了遗传学、基因组学、免疫学和癌症等多个领域的功能发现。然而，人类疾病的基因多效性和基因相互作用网络的复杂性需要一种能够同时进行多重基因编辑的敲入小鼠模型。为此，耶鲁大学的陈斯迪教授团队开发了一系列背景为C57BL/6的 Cre依赖的条件性表达小鼠或组成性表达Cas12a小鼠模型，包括LbCas12a和高保真增强版AsCas12a
（enAsCas12a-HF1）
。
研究团队首先通过与CMV-Cre小鼠交配获得了组成性表达Cas12a蛋白的小鼠，验证了Cas12a蛋白的表达及在不同主要器官中的表达量，并通过全鼠表型分析证实Cas12a的组成性表达并未导致与C57BL/6背景品系相比的任何可辨别的病理差异。通过使用LbCas12a和enAsCas12a小鼠原代免疫细胞，他们在T细胞和骨髓来源的树突状细胞
（BMDCs）
中实现了高效的双基因编辑
（Double Knockout）
。高通量测序结果显示，使用enAsCas12a老鼠系统可以在这些细胞类型中实现高达90%的基因编辑效率。
为了验证Cas12a敲入小鼠在体内基因编辑中的应用，研究团队使用LNP系统将靶向Ttr基因的CRISPR RNA
（crRNA）
递送到组成性表达enAsCas12a的小鼠体内。实验结果显示，注射后6天，血清中TTR蛋白水平显著下降，并在20天内保持稳定。这表明，LNP-crRNA系统在体内具有高效的基因靶向能力。为了进一步验证Cas12a敲入小鼠优越的的体内基因编辑效率及在癌症建模中的应用，研究团队设计了一个包含四个肿瘤抑制基因
（Trp53、Pten、Apc和Rb1）
的AAV-crTSG表达阵列，并通过AAV系统递送到条件性表达enAsCas12a小鼠体内。结果显示，注射后一个月内，所有注射AAV-crTSG的小鼠均在头颈部位形成了侵袭性肿瘤，而对照组小鼠
（注射AAV-vector）
未观察到肿瘤形成。组织学分析显示，这些肿瘤具有典型的鳞状细胞癌特征，并且肿瘤细胞中表达enAsCas12a-HF1-GFP蛋白，表明肿瘤的形成是由AAV-crTSG介导的基因编辑引起的。
为了实现同步基因激活和敲除，研究团队将LSL-enAsCas12a-HF1小鼠与dCas9-SPH转基因小鼠交配，生成了LSL-enAsCas12a-HF1;dCas9-SPH双转基因小鼠。双转基因老鼠及配合设计的一个包含Cas9-sgRNA和Cas12a-crRNA的融合引导RNA系统，研究团队建立了一个同时进行双基因激活和敲除
（DAKO）
的系统。DAKO系统的有效性在BMDC细胞实验中得到验证，流式分析实验结果显示，DAKO系统在单个细胞水平上同时实现双基因激活和敲除，为研究复杂基因相互作用网络提供了强大的工具。
Cas12a敲入小鼠的开发为多重基因编辑、疾病建模和免疫遗传学研究提供了一个强大的平台。这些小鼠品系及其伴随的病毒和非病毒递送载体，共同构成了一个广泛适用的工具包，能够应用于基因编辑、免疫细胞工程、免疫学发现和复杂基因相互作用的解卷积。
随着递送载体的优化及靶点组合的精确设计，Cas12a敲入小鼠有望在临床治疗中发挥重要作用，不仅应用于肿瘤治疗，还可扩展至其他疾病领域，为精准个性化治疗和通用治疗铺平道路。
本研究由耶鲁大学陈斯迪教授课题组主导完成。耶鲁大学博士学生唐开元和周立群为该论文的共同第一作者。陈斯迪教授，约翰霍普金斯医学院Matthew Dong
（MD PhD）
和即将成为威斯塔研究所
（The Wistar Institute）
独立PI的周小宇博士为该论文的共同通讯作者。
周小宇博士的研究重点是利用免疫工程和基因组编辑方法开发创新型免疫疗法，将于近期加入美国费城威斯塔研究所担任独立PI组建研究团队，未来实验室将结合免疫学、遗传学和生物信息学，研究细胞间通讯并开发针对肿瘤的新型免疫疗法。欢迎对肿瘤免疫学，基因编辑感兴趣的毕业生（具有肿瘤、免疫学，分子生物学或生物信息学背景更佳）投递简历。
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https://www.nature.com/articles/s41551-025-01371-2
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