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Lumican通过H3组蛋白乳酸化加重钙化性主动脉瓣病

BCML速递 · 公众号 · · 2024-11-09 22:00

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钙化性主动脉瓣病（ CAVD ）是一种常见的心血管疾病。迄今为止，尚未发现任何有效药物阻止或减缓 CAVD 的进展。尽管人们已经对 CAVD 的发生和发展做了许多研究，但其主要的调节因素和分子机制仍不清楚。

Lumican （ LUM ）是一种普遍存在的细胞外基质（ ECM ）成分，是一种小分子富亮氨酸蛋白聚糖。据报道，它可以调节多种组织（如心脏、肝脏和肺）中的纤维化和钙化病变。大量研究表明 LUM 与炎症性疾病和动脉粥样硬化密切相关，但它在瓣膜钙化中的具体作用仍未得到充分研究。了解其在介导瓣膜钙化中的作用可能使其成为 CAVD 的新治疗靶点。

研究表明瓣膜间质细胞（ VIC ）在各种因素的刺激下获得表达关键成骨标志物的钙化特性，这对于主动脉瓣钙化的发生和发展至关重要。研究者的早期研究显示 VIC 首先产生多种过渡态细胞亚群，然后转化为成骨表型细胞亚群，从而启动瓣膜钙化。然而，控制 VIC 成骨转化的确切信号机制仍不清楚。基于此，研究者们进一步使用来自不同年龄段个体的主动脉瓣样本进行单细胞测序（ scRNA-seq ），以阐明可能导致钙化的 VIC 病理转变，并确定与这一进展有关的关键因素。通过 scRNA-seq 数据，研究者们成功描绘了 VIC 的病理转变过程，并强调了 LUM 在 CAVD 中的重要性。

研究者首先对九个主动脉瓣组织样本进行了单细胞测序。九个样本分为三组： CAVD 组、对照青年组和对照老年组（图 1A ）。基于基因表达，细胞被分为 11 个亚群（图 1C-D ）。堆叠直方图描绘了每个样本中不同亚群占总细胞数的相对比例（图 1E ）。热图直观地表示了各个亚群之间基因表达的差异（图 1F ）。散点图有助于识别与 11 个亚群中的每一个亚群相关的特定表达基因（图 1G ）。

研究者通过单细胞测序发现 LUM 在 CAVD 的早期阶段起着重要作用。在年轻组中，各亚群的比例保持相对平衡。老年组中亚群 1 的比例明显升高，成为瓣膜间质细胞的主要成分。在 CAVD 组中，亚群 2 和亚群 6 成为优势亚群，将他们命名为 CA-VIC 。亚群 1 与 VIC 组中的其他亚群具有相互转换关系，并且似乎与 CA-VIC 的位置更接近（图 2C ）。因此，研究者进行了两个不同阶段的拟时间分化轨迹分析：从年轻组到老年组以及从老年组到 CAVD 组。在第一阶段，大多数亚群 1 细胞处于分化的末期，在这些细胞中 LUM 显著上调（图 2D ）。在 CAVD 疾病进展过程中，亚群 1 细胞转化为 CA-VIC ，并且 LUM 基因在整个过程中持续上调（图 2E ）。对各组样本进行 KEGG 分析发现，组蛋白修饰在 CAVD 组中表现出显著的影响。从上述分析中可以推断，亚群 1 在 CAVD 的初始阶段起着至关重要的作用，其独特基因 LUM 可能成为其功能的关键决定因素。

随后，研究者进行了 LUM 表达与钙化水平的相关性分析。人类主动脉瓣组织样本相关结果显示，与对照组相比， CAVD 组的 LUM 和 BMP2 表达水平显著增加（图 3B 和 C ）。此外，研究者观察到 LUM 和 BMP2 表达之间存在直接相关性（图 3D ）。主动脉瓣钙化离体模型的相关结果显示钙化组的 LUM 表达显著增加（图 3F 和 G ）。在体外模型中，钙化模型组 LUM 表达显著增加（图 3J 和 K ）。同时，在动物钙化模型中也观察到了同样的结果（图 3M-P ）。

研究通过 LUM 的过表达和敲除进一步验证了其和主动脉瓣钙化的关系。在成骨培养基（ OM ）诱导下， LUM 过表达的组中观察到更明显的钙化（图 4A ）。同时发现，在 OM 诱导后， ALPL 、 BMP2 和 Runx2 的表达显著升高（图 4C ）。当 LUM 基因被敲低时，钙化明显受到抑制（图 4B ），同时 ALPL 、 BMP2 和 Runx2 的表达也受到明显抑制（图 4D ）。在离体钙化模型中， LUM 的上调对瓣膜组织的钙化有明显促进作用（图 4E ）。此外，研究者建立了 ApoE ^−/− 和 LUM ^−/− 双敲除小鼠，并对其进行主动脉瓣钙化诱导。研究发现， LUM 缺陷可有效抑制主动脉瓣的钙化沉积（图 4G 和 K ）。与对照组相比，高脂饮食的 ApoE ^−/− 组的主动脉瓣厚度、主动脉瓣内压力和主动脉瓣内速度均显著增加。然而，在 LUM 基因敲除后，这种影响被部分抵消（图 4H-J ）。

为了研究 LUM 促进 CAVD 的分子机制，研究者进行了多组学分析，包括转录组和代谢组。研究者对有和没有 LUM 过表达处理的 VIC 进行了 RNA 测序分析，结果显示 TNF 信号通路、细胞因子 - 细胞因子受体相互作用和 NOD 样受体信号传导是与 LUM 介导效应相关的三大最活跃的信号通路（图 5D ）。利用 3D-PCA 、 PCA 和 OPLS-DA 聚类分析对差异代谢物进行分析，发现在 OM 诱导下， LUM 的过表达对 VIC 代谢有显著影响（图 5E-G ）。 LUM 的沉默抑制了葡萄糖和乳酸的产生（图 5N 和 O ）。这一发现表明 LUM 过表达诱导向糖酵解而非脂质代谢的转变。同时，研究者评估了 LUM 过表达和沉默的 VIC 的细胞外酸化率（ ECAR ）作为细胞糖酵解应激的衡量标准（图 5K 、 P ）。结果表明，与 OM 组和对照组相比， OM+LUM 组的细胞糖酵解应激显著增加，糖酵解增强（图 5L 、 M ）。同时，研究者发现 LUM 对 CD44 和 ITGB1 受体均表现出亲和力， CD44 和 ITGB1 敲低减弱了 LUM 的促钙化作用（图 5T-V ）。

前述代谢组学分析表明，在 LUM 过表达后，糖酵解会发生显著的生物学改变。因此，研究者将注意力转向糖酵解与组蛋白修饰，特别是乳酸化之间的关系。使用 Pan-Kla 抗体的流式细胞术分析表明，在 OM 诱导后，整体乳酸化水平显著增加（图 6A ）。免疫荧光染色显示， LUM 过表达和 OM 刺激均有助于增强 VIC 中的乳酸化修饰（图 6B 和 C ）。在不同刺激条件下对 VIC 中的 H3K9la 和 H3K14la 进行了检查，研究结果表明， OM 刺激显著上调 H3K9la 和 H3K14la 的表达。 OM 和 LUM 过表达的联合作用进一步增强了这种效果（图 6E 、 F ）。为了验证这些发现，研究者进行了反向验证。结果表明，在 OM 处理的情况下，没有 LUM 会导致乳酸化水平降低，特别是与 H3K9 和 H3K14 相关的乳酸化。此外，钙化样本 VIC 中整体乳酸化水平也显著高于健康样本（图 6H-J ）。 LUM 表达与乳酸化水平（特别是 H3K9la 和 H3K14la ）共表达分析呈现线性相关性（图 6K-M ）。 ChIP-PCR 结果证明组蛋白乳酸化在增强 BMP2 和 Runx2 基因转录中发挥作用（图 6N ）。值得注意的是，修饰位点 H3K14la 调控 BMP2 基因（图 6O ），而修饰位点 H3K9la 调控 Runx2 基因（图 6P ）。

总的来说，该研究定位了一个特殊的细胞亚群，该亚群可能成为推动 CAVD 进展的关键细胞群。研究者发现 LUM 升高有助于引发炎症反应和通过糖酵解产生乳酸，这两者都与钙化有关。 LUM 在促进 H3 组蛋白乳酸化修饰方面发挥着迄今为止未被认识的额外作用，这对于捕获靶基因至关重要。更重要的是，消除 LUM 会导致乳酸化减少，同时在体外、体内和离体条件下的钙化得到改善。因此，抑制 LUM 可能成为一种新的 CAVD 治疗策略。这些新发现为 CAVD 中 LUM- 代谢组 - 表观基因组级联的机制提供了新的视角。

该研究由湖北中医药大学、湖北时珍实验室许康教授、王春莉副教授团队，华中科技大学同济医学院附属协和医院董念国教授团队以及华中科技大学的史嘉玮教授团队合作完成，并于 2024 年 7 月发表于 European Heart Journal 。

文章信息： Huang Y, Wang C, Zhou T, Xie F, Liu Z, Xu H, Liu M, Wang S, Li L, Chi Q, Shi J, Dong N, Xu K. Lumican promotes calcific aortic valve disease through H3 histone lactylation. Eur Heart J. 2024 Oct 5;45(37):3871-3885.

供稿：季威

审校：孙亨

编辑：陆凯