2025年1月4日，浙江大学车金鑫/董晓武团队在国际顶级药物化学期刊《Journal of Medicinal Chemistry》上发表了一篇题为Auto-RapTAC: A Versatile and Sustainable Platform for the Automated Rapid Synthesis and Evaluation of PROTAC的论文。
该研究针对PROTAC发现过程中合成繁琐和生物活性评估通量有限的难题，创新性地构建了Auto-RapTAC平台，实现了PROTAC的自动化快速合成和高通量评估。
通过该平台，研究团队在短时间内针对多个靶点成功识别出新的PROTAC先导化合物，为PROTAC药物的快速开发提供了强有力的工具和方法，有望推动蛋白质降解药物研究的进一步发展。
PROTAC（蛋白质降解靶向嵌合体）的设计在很大程度上依赖于经验方法，繁琐的合成程序和具有挑战性的纯化对结构多样性的PROTAC的合成构成了重大挑战。此外，PROTAC活性评估的大部分工作传统上依赖于Western blot来观察细胞裂解物中蛋白质水平的变化，但其生物测定通量不足常常阻碍了对构效关系（SAR）的理解和PROTAC效力的快速验证。因此，这些问题极大地限制了预期的快速PROTAC发现。考虑到PROTAC是一类异双功能分子，其模块化特性使得其两个结构组分可以预先组合，从而形成构建块库。
许多合成方法已被研究，如“点击化学”、无痕Staudinger连接、RapidTAC和“直接到生物学（D2B）”方法。这些预组装的基元通常在适当的末端功能化以引入特定的官能团，并已有效地用于识别针对BRD4、FGFR1、PARP1等靶标的强效PROTAC。研究启发认识到，反应就绪的合成构建块可以显著简化降解剂的组装，并大大加快PROTAC的制备。此外，生物相容的反应系统可以直接用于后续的生物评估而无需进一步纯化；例如Rapid-TAC和preTACs-cytoblot平台已展示了用于高通量评估PROTAC的“Ready-for-screening”（R4S）策略。因此，假设将构建块库与R4S结合可以进一步加快发现过程，但仍然需要大量人工干预，可能会限制该策略的应用。
近年来，机器人实施的自动化化学实验标志着人工智能（AI）驱动实验室的开始。如SynCar、ASL、chemputer和AutoSyn等药物分子的自动化合成技术，不断推动自动化技术和化学合成的融合。然而，当前的自动化合成技术大多集中在具有相对简单和固定合成过程的聚合物，如多肽、寡糖和寡核苷酸。此外，自动化合成平台依赖于特定的合成方法。活性分子的获取必须经过广泛的生物筛选和评估。这表明自动化系统的干预可能有助于PROTAC的合成和标准化产品，这对于R4S策略所需的直接生物评估尤为重要。然而，大多数机器人系统价格昂贵且需要在复杂的实验室环境中操作。因此，开发一种新的可持续的机器人系统以将构建块库与模块化PROTAC组装相结合是非常必要的。
在获得PROTAC分子实体后，其活性评估是发现PROTAC的另一个主要速率限制步骤。传统的Western blotting方法需要多次洗涤和孵育步骤，如低通量使其不适合快速初步筛选。此外，一些方法和技术的出现并帮助加速了蛋白质水平变化的测试工作，包括荧光蛋白融合和报告标签、流式细胞术、时间分辨荧光能量转移（TR-FRET）和分裂荧光素酶系统。例如，基于毛细管电泳免疫分析（CEI）的数字Western blot技术，已自动化了蛋白质分离和免疫检测程序，将获得定量结果的过程缩短到不到3小时。此外，更高通量的检测技术正逐渐实施，如Nano-Glo HiBiT检测系统和基于荧光的筛选，这些技术促进了基于高通量板和时间依赖性评估，从而加速了PROTAC的评估。这些启发研究人员将检测技术整合，促进特定降解蛋白的快速筛选，并进一步缩短PROTAC的评估周期。
为此，
研究人员提出并建立了一个名为Auto-RapTAC（自动化辅助快速PROTAC发现）的平台，可以高效地识别新的PROTAC。
通过整合构建块库、自动化合成和快速评估，增强的工作流程使得在8天内发现针对一个靶标的PROTAC成为可能。借助该平台，研究人员对三种类型的靶标进行了确认工作，包括CDK2、CDK12和BCL6，这为Auto-RapTAC平台快速发现新的先导PROTAC的能力提供了概念验证。共制备并评估了160种PROTAC，发现了六种高效的降解剂，它们可以作为工具分子或进一步效力研究的有前途的起点。此外，整个过程还在短时间内提供了一些信息，包括初步的SAR、靶标的可降解性和最佳E3连接酶的招募。
作者基于PROTAC分子的模块化特性及R4S准则，构建了Auto-RapTAC体系架构。
首先，受 “click chemistry” 启发，利用铜催化的叠氮-炔烃环加成反应（CuAAC）构建了包含POI弹头库（PWL）和E3配体-连接子共轭物库（ECL）的 “Easy Pack” 库，对配体进行修饰以引入特定官能团。在此基础上，开发了自动化合成PROTACs的新架构，将起始原料溶解于DMSO溶液，通过包含机械臂、液体分配设备、封盖设备、反应区和HPLC转化分析等模块的自动化干预进行操作，产物无需进一步纯化即可用于后续生物测试，实现了PROTAC组件的正交组装。同时，开发了基于网络的控制软件，集成用户权限管理、数据库、任务提交和实时摄像头等功能，用户可远程登录局域网访问、控制平台并查看实时画面，数据库用于记录原始PWL/ECL信息，任务提交模块可编辑反应参数驱动自动化平台组装，摄像头模块可上传实时图像便于远程监控。
首先，为满足生物相容性要求并加速自动化合成的转化，针对CuAAC反应的正交组装条件进行优化实验。以特定的POI配体和E3配体片段为模型底物，筛选如E5当量、催化剂/配体比例、反应温度和时间等变量，并通过HPLC系统比较反应序列的粗纯度。结果表明，提高CuSO₄/TBTA摩尔百分比、反应温度和E5当量可提升转化率，综合考虑后续实验流程，确定反应时间为3小时等组装策略条件。
接着以CDK2为靶点进行概念验证研究。选择CDK2抑制剂的衍生物作为弹头，结合修饰后的E3配体-连接子共轭物，利用平台进行自动化组装。反应完成后经HPLC分析，96个CuAAC反应中82个POI弹头转化率超70%，体现了该组装策略的高反应性和广泛适用性。在R4S原则下，通过基于GFP的荧光测定法对反应混合物直接进行高内涵荧光成像评估降解效果，多数PROTAC化合物显著诱导CDK2降解，部分组合的降解能力与基准化合物CPS2相当或更强。初步筛选后对部分化合物进行放大合成和纯化分析，确定了活性CDK2 PROTACs的相关SAR，如连接子主要为特定长度的烷基链，且主要通过招募CRBN和VHL配体发挥作用，其中VHL招募配体降解活性更优，整个过程在8天内成功鉴定出强效的CDK2 PROTACs，证明了平台在快速发现新型PROTACs方面的高效性。
针对CDK12和BCL6的PROTACs自动组装与评估过程
鉴于CDK12在DNA损伤反应基因转录中的关键作用及当前抑制剂的毒性问题，以及BCL6在弥漫性大B细胞淋巴瘤发生中的重要性和其作为治疗靶点的潜力，研究选取相关衍生物修饰为弹头（CDK12弹头P4、BCL6弹头P5），并结合ECL利用Auto-RapTAC平台进行快速自动化组装。结果显示，64个反应转化率较高，部分产品转化率超60%，最高达90%，表明组装策略具有一定底物耐受性。随后分别在Hela细胞系（通过cytoblot分析）和HEK 293T细胞系（基于GFP的荧光分析）中评估CDK12和BCL6 PROTACs的降解能力，多数CDK12组装产物在1 μM浓度下表现出高降解率，特定的 VHL和MDM2招募的PROTACs降解率超 60%；BCL6 PROTACs中部分含特定碳链长度脂肪族连接子的化合物效果最佳。进一步对筛选出的领先PROTAC候选物（CDK12的P4E28、P4E30和BCL6的P5E17、P5E27）进行放大组装、纯化和重新评估，合成过程在2小时内完成且转化率超70%，纯化后纯度超95%，Western blotting 结果显示这些PROTACs在低浓度下具有良好降解活性且呈剂量依赖性，未出现钩状效应，最终确定了它们针对相应靶点的DC50值，证明了平台合成的PROTACs对目标蛋白具有靶向降解效能。
目前，
自动化合成主要集中在两个方向：第一个方向是高度定制化的平台
，这些平台根据特定化合物的工艺特性整合各种设施，如泵、电磁阀和反应器，专门设计用于合成特定化合物或其直接相关的衍生物。
第二个方向是通用合成平台
，这些平台不限于特定分子，而是设计用于容纳广泛的化学转化策略和常见操作。例如，AbbVie、Sanofi、Eli Lilly和AstraZeneca等公司开发了多种形式的自动化合成平台，能够支持包括酰胺偶联、还原胺化和Suzuki偶联在内的多种反应。
尽管自动化合成平台取得了显著进展，但仍存在一些挑战：
（1）现有平台主要解决特定领域的问题，具有有限的通用性和高昂的建设成本，限制了其广泛应用。
（2）许多硬件模块控制端口未开放，使得与自动化系统的整合变得复杂。
（3）参与合成的人员通常缺乏机械设计和软件编程的专业知识，需要与这些领域的专业人士合作，可能导致沟通困难。
（4）这些平台生成的数据存储和使用的标准化问题尚未解决。
因此，在解决这些挑战的同时，考虑开发成本效益高的平台以解决特定科学问题是一个值得探索的方向。由于PROTAC三元复合物的作用机制复杂且传统合成路线较长，PROTAC的快速发展受到显著阻碍。目前，已研究了多种合成方法，如“Rapid-TAC”和“direct-to-biology（D2B）”方法。这些快速发现PROTAC的化学方法为自动化合成平台的发展奠定了基础。因此，开发一个整合快速合成方法的模块化自动化平台以加速PROTAC分子的发现具有极其重要的意义和价值。
本研究建立了一个基于传统批量反应模型的轨道式机械臂辅助自动化合成工作站，以实现PROTAC的快速组装。通过实施这一协同硬件-软件自动化合成平台，快速识别了针对CDK2、CDK12和BCL6的PROTAC。这些结果表明，
AutoRapTAC平台可以显著提高PROTAC的合成前景，从而加快其发现
。
因此，该平台的优势包括：
