通过一篇文章掌握多个微生物组应用方法

基迪奥生物 · 公众号 · · 2024-11-13 18:01

正文

16S扩增子测序作为微生物研究中最方便的组学，通过实验+16S测序挖掘微生物间的动态关系是研究微生物在群落中作用的重要方式，但仅靠单一或少量的16S测序已经无法满足目前的研究需求，那我们应该如何应用16S数据为研究“添砖加瓦”呢？

联合多组学分析或提升样本数的大样本分析是目前高分研究中常见的16S应用方法，可以分为以下4个应用点：

“微生物+微生物”— 16S+宏基因组

由于16S在扩增时存在一定的偏好性，低丰度的物种无法识别，宏基因组由于是提取环境中的总DNA，因此低丰度的物种也会有所捕获。此外，16S在功能研究上的短板也会被宏基因组补齐，两种组学起到分析互补的效果，多应用于同时研究微生物群落与功能的情况。但在分析时应注意，2个不同的组学在物种注释上使用不同的数据库可能会在物种名称上有一定的差异。

“微生物+宿主”—16S+转录组

在挖掘宿主响应的分子机制与微生物群落变化情况的研究中，16S+转录组是最常用的多组学方式。转录组起到识别关键基因的作用，结合实验对识别的关键基因进行验证； 16S可以作为另一层面的宿主表观现象的反馈，通过群落水平的变化反向验证挖掘到的关键基因是否起作用。

“微生物+产物”—16S+代谢组

无论是自然环境还是宿主内环境，微生物产生的多种代谢产物是影响环境变化的重要原因。代谢组可以找到影响宿主或环境的关键代谢产物，结合16S可以找到与关键代谢产物强关联的微生物，结合实验可以进一步验证代谢物与微生物群落变化的关联。然而由于16S无法深入研究微生物的功能，因此代谢组更多与宏基因组关联分析。

“大量微生物组”—16S大样本

大样本可以通过机器学习或差异分析的方式识别关键的生物标记物，也是排除样本特异性挖掘普遍规律的重要手段，大样本16S测序也逐渐成为了验证微生物群落分布规律的重要方式。

基迪奥客户发表的一篇文章中同时使用了3种微生物组应用方法，下面我们一起通过这篇文章来看看如何实际应用这些方法吧~

文章解读

文章题目：

中风后激活的交感神经下调Toll样受体5并破坏肠壁屏障

发表期刊：

Cell Reports Medicine （IF=11.7）

合作单位： 南方医科大学

发表时间： 2024年10月

研究背景

缺血性中风约占87%占总中风的比例，目前是神经病学研究的主要焦点之一。研究表明，中风会导致肠道屏障受损进而加剧中风的症状，但中风后肠道屏障如何被破坏仍不清楚。

研究思路

第一步：16S+宏基因组

设置幽门螺旋杆菌感染破坏肠道黏膜的假手术组作为对照组，测定假手术组与中风后1h、2h的MCAO模型组的16S，识别破坏肠道屏障的关键微生物，进一步测定假手术组和2h组的宏基因组进行分析验证16S结果。

第二步：转录组+16S

测定假手术组与2h组小鼠肠道转录组，识别响应的关键基因；设置敲除与对照组，测定肠道微生物的变化是否符合预期。

第三步：16S大样本

测定临床患者与健康捐赠者的肛拭子微生物，验证实验识别的关键物种是否在临床中普遍观察到。

研究结果

16S+宏基因组：破坏肠道粘液层的微生物识别

设置幽门螺旋杆菌破坏肠道粘膜的假手术组作为对照，通过16S测序观察假手术组、1h组和2h组肠道微生物群落组成。结果显示，2h组Alpha多样性显著增加，Beta多样性结果显示2h组与假手术组、1h组微生物组成有显著差异。物种组成分析结果显示，2小时组门水平的 Proteobacteria 和属水平的 Helicobacter 的丰度显着增加。LEfSe差异分析的结果也显示 Proteobacteria 门的 Helicobacter 属是2h组的主要差异物种。 Proteobacteria 和 Helicobacter 通常是有鞭毛的细菌，在2小时组中，预测的基因功能（包括鞭毛组装、细菌趋化性、细菌运动蛋白和表皮细胞信号传递）显着增加。将粪便与粘液微生物比较哦发现，两者微生物组成之间有显著差异，2h组的粪便微生物中 Proteobacteria 和 Helicobacter 的丰度并没有明显增加，这表明粘液微生物群由于与宿主接触更密切，更快地受到宿主生理变化的影响。

图1 16S揭示中风后肠道微生物变化

为了进一步识别关键物种，对假手术组和2h组的肠道微生物进行宏基因组测序。Beta多样性结果显示，两组之间微生物组成有显著差异，2小时组的 Proteobacteria 门， Helicobacter 属， Helicobacter ganmani 种的丰度高于假手术组，进一步确定 Helicobacter 的关键作用。LEfSe结果显示，差异物种更多集中于鞭毛细菌，进一步表明鞭毛细菌对肠粘膜损伤的重要性。

图2 宏基因组进一步识别影响肠粘膜的关键微生物

通过实验研究去除肠道微生物是否会减轻粘液屏障损伤，结果表明，肠道微生物群的缺乏可以保护大脑免受缺血性损伤，粘液微生物群负荷的减少对小鼠的粘液层和脑损伤产生了有益的影响，肠道微生物对粘液层破坏起重要作用，细菌鞭毛蛋白注射实验结果进一步解释了鞭毛蛋白对粘液层破坏的影响。

转录组+16S：中风后肠道微生物变化机制

对假手术组和2h组小鼠结肠进行转录组测序，研究粘液微生物变化的潜在机制。转录组结果显示，一种识别细菌鞭毛蛋白的受体Tlr5的表达表现出最显着的变化、免疫球蛋白（Ig）相关基因的下调。进一步通过PCR与蛋白杂交实验证实了TLR5的下调；检测总IgA与鞭毛蛋白特异性IgA水平，证实总IgA水平无显著差异，2h组鞭毛蛋白特异性IgA水平降低。鞭毛蛋白标记检验显示，鞭毛细菌在2h组能够突破粘液屏障到达表皮，在2h组血液、结肠、肝脏中均检测到鞭毛蛋白水平升高。

通过一篇文章掌握多个微生物组应用方法

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