手把手教学｜如何分析qPCR的数据

实验老司机 · 公众号 · · 2025-01-24 07:00

正文

实时荧光定量 PCR （简称 RT-qPCR ），通常将提取细胞或者组织的总 RNA 逆转录成 cDNA 。之后以 cDNA 为模板，以 dNTP 为底物，对扩增出的 DNA 进行定量分析。

在这里以下是对miR-A的qPCR数据（来自Bio-Rad仪器）进行统计分析的 详细步骤 ：

（1）以miR-A为目的基因，内参为U6：检测相对于对照组，实验组miR-A的相对mRNA表达水平，以下为Bio-Rad仪器导出的数据：

图 1 原始数据

（2）拿到原始数据我们一般只需看图1中标红的①②③列数据，并将数据复制粘贴值新的工作表中，对数据进一步处理。对目的基因进行相对定量分析，则使用ΔΔCt法，Bio-Rad仪器中的Cq即为基因的“CT值”，计算公式如下：

实验组目标基因相对于对照组的相对表达量=2 ^-ΔΔCt

1）A:计算Ct值：分别测定目的基因和内参基因在实验组和对照组中的Ct值，即原始数据中的Cq值。

B:计算ΔCt值：对于每个样本，计算目的基因与内参基因的Ct值之差（ΔCt = Ct目的基因-Ct内参基因）。

C:计算ΔΔCt值：实验组ΔCt值与对照组ΔCt值之差（ΔΔCt = ΔCt实验组 - ΔCt对照组）。

（3）计算原始数据，我们在新的Excel工作表中制作以下表头：

图 2 表头以及数据统计

（4）具体计算步骤：

1）用【average】函数分别求出对照组和实验组中U6内参Cq值的平均值；

图 3 内参 Cq 值的平均值

注意：目的基因的Cq值减去内参基因的Cq值的平均值，是用于归一化目的基因和内参基因的反应量，从而消除实验操作和RNA提取效率等因素的影响，得到更准确的相对定量结果。

2）随后，再用①对照组和实验组目的基因的各个Cq分别减去②内参Cq值的均值即为③ΔCq；之后求出④对照组（目的基因Cq-内参Cq均值）的均值；

图 4 实验组Δ Cq

图 5 对照组Δ Cq

图 6 对照组（目的基因 Cq- 内参 Cq 均值）的均值

3）③目的基因的各组ΔCq值再减去④对照组（目的基因Cq-内参Cq均值）的均值即为⑤ΔΔCq，最后用【Power】函数计算2-ΔΔCq值，：

图 7 ΔΔ Cq 计算

4)最后用⑥【Power】函数计算2 ^-ΔΔCq 值，excel选择下拉得到所有值，具体计算如下：如图3：

图 8 【 Power 】函数计算 2 ^-ΔΔCq 值

5)整体计算数据如下，我们最后求出三次技术重复的平均值⑦，即为我们一次生物学重复的值:

图 9 整体数据计算

（5）因此，步骤（4）中计算得出了一组数据即为一次生物学重复，将对照组的目的基因表达标准化。相对于对照组，实验组的miR-A的相对表达量降低了；但实际上我们需要三次生物学重复才能得到这样的结论。

注意：技术重复是指相同的样品同时做3-4个平行，用于消除人为的系统误差，筛选测出比较准确的值；而生物学重复是指我们需要消除样品的差异，避免结论的偶然性，即不能用一次生物学重复便得出结论。例如一些临床样本可能就需要一般患者和健康者的样本数要n>15。图3中Test/Normal的3个数据分别为一次技术重复，一组为一次生物学重复。

（6）统计分析：使用适当的统计检验方法（如T检验、ANOVA等）来评估不同组之间基因表达差异的显著性。图中我们以三个技术重复为例用graphpad prism作为分析miR-A的相对表达量。结果用Graphpad软件作图如下：