ACS Sensors：饶毅团队开发一种用于精氨酸的基因编码探针

生物学霸 · 公众号 · 生物 · 2025-02-17 17:31

正文

来源：生命科学联合中心、丁香学术

原文链接

DOI: 10.1021/acssensors.4c03174

L-精氨酸（Arg）在多种代谢和生理过程中发挥着重要作用，其浓度的变化与病理过程密切相关。2025 年 1 月 21 日，饶毅课题组在 ACS Sensors 期刊发表题为 「Development of a Genetically Encoded Sensor for Arginine」 的最新研究成果。本研究开发了一种新的 Arg 探针 ——ArgS1，可有效在生理和病理相关动态范围内实时监测人类细胞中的 Arg 水平。

王纯，张小雪，毛浩雨，咸逸，饶毅

🔹摘要🔹

L-精氨酸（Arg）在多种代谢和生理过程中发挥重要作用，其浓度的变化与病理过程密切相关。尽管直接且实时测量生物系统中的 Arg 水平非常重要，但现有的 Arg 探针对 L-鸟氨酸或 L-赖氨酸也有响应。本文报道了一种新的 Arg 探针 ArgS1。该探针对 Arg 表现出浓度依赖性的 Ex488/405 比率增加，其表观亲和力约为 64μM，动态范围（ΔR/R0）为 3。ArgS1 在细胞质和亚细胞器中对 Arg 均有响应。ArgS1 成功监测了 MDA-MB-231 细胞（一种缺乏 Arg 合成关键酶 —— 精氨琥珀酸合成酶 1（ASS1）的乳腺癌细胞系，且适用于 Arg 耗竭疗法）中的 Arg 水平。研究发现，当细胞外 Arg 被耗竭后，MDA-MB-231 细胞中的 Arg 水平下降，同时细胞活力也随之降低。当细胞中过表达 ASS1 时，Arg 水平上升，细胞活力也得到增强。因此，ArgS1 是一种在生理和病理相关动态范围内实时监测人类细胞中 Arg 水平的有效工具。

L-精氨酸（Arg）是一种条件性必需氨基酸，在人体中具有重要的生理作用 [1, 2]。Arg 的主要来源包括蛋白质降解、膳食摄入和从头合成 [3]。Arg 的合成涉及两种关键酶：精氨琥珀酸合成酶（ASS），它将 L-瓜氨酸（Cit）转化为精氨琥珀酸；以及精氨琥珀酸裂解酶（ASL），它将精氨琥珀酸裂解为 Arg[4, 5]。Arg 在一氧化氮合酶（NOS）的催化下生成 Cit 和一氧化氮（NO），Arg 是 NO 的唯一直接前体 [6-9]。Arg 还参与尿素循环，在精氨酸酶（ARGs）的作用下被水解为尿素和 L-鸟氨酸（Orn）[10, 11]，这对于氨的解毒至关重要 [12]。精氨酸：甘氨酸脒基转移酶（AGAT）是一种线粒体酶，它催化 Arg 生成胍基乙酸，这是肌酸合成的直接前体 [13-15]。Arg 代谢紊乱与多种疾病相关 [5, 16]。精氨酸酶 1（ARG1）缺乏会导致高精氨酸血症，这是一种以进行性神经系统症状为特征的罕见遗传性代谢疾病 [17]。Arg 还与多种疾病的治疗相关，例如勃起功能障碍 [18, 19]、高血压 [20] 和心力衰竭 [21]。

癌细胞的生存和生长需要氨基酸 [22-24]，其中 Arg 是肿瘤微环境中的重要组成部分 [25-27]。某些类型的癌症，如乳腺癌 [28]、黑色素瘤 [29]、肝细胞癌 [30]、急性淋巴细胞白血病（ALL）[31] 和急性髓系白血病（AML）[32]，其 ASS 表达缺失。这些类型的癌细胞依赖摄取细胞外 Arg 以维持生存，因此限制 Arg 供应已被探索为癌症治疗中的一种潜在辅助治疗策略 [27, 33]。在培养基中去除 Arg 或添加 ADI-PEG20（聚乙二醇化精氨酸脱亚氨酶）可导致 ASS1 缺陷型癌细胞在体外被清除 [28, 34]。系统性给予 ADI 或精氨酸酶以限制 Arg 可用性，已在肿瘤治疗的 II 期临床试验中进行了研究 [35]。这些研究表明，ASS1 缺陷是 AML 患者对 ADI-PEG20 单药治疗产生反应的必要条件，但并非充分条件。Arg 的测量是确定患者是否适合接受 ADI-PEG20 治疗 AML 的重要指标。

传统的 Arg 测量方法包括样品的微透析 [36, 37] 和化学分析 [38]，这些方法无法研究细胞内分布的变化，也无法以必要的空间和时间分辨率分析 Arg。荧光探针提供了非侵入性实时测量浓度及其时空变化的可能性。现有的基因编码 Arg 荧光探针基于 Förster 共振能量转移（FRET），其动态范围相对较小 [39-41]。这些探针在体外报道的最大动态范围仅为约 0.6[40]。更大的问题在于其特异性：这些探针不仅对 Arg 有响应，还对其他氨基酸（如 Orn、L-赖氨酸（Lys）、L-谷氨酰胺（Gln）和 L-组氨酸（His））有响应 [39-41]。此外，这些探针对 Arg 的解离常数（Kd）（9.4 或 14μM）[39, 40] 不适合检测生理水平的 Arg，因为血浆 [42] 和细胞质 [43] 中的 Arg 浓度通常约为 100µM。

因此，需要开发具有大动态范围和合适 Kd 的基因编码 Arg 特异性荧光探针，以用于生理和病理条件下 Arg 的检测。

🔹 结果 🔹

Arg 探针的设计、优化及体外表征

我们基于大肠杆菌（E. coli）的 artJ（一种周质结合蛋白，PBP）设计了一种基因编码的荧光 Arg 探针。artJ 在结合 Arg 时会发生构象变化 [44-46]。与其他探针的设计类似 [47-50]，我们将来自 GRABDA2m 的环状置换绿色荧光蛋白（cpEGFP）[51] 整合到 artJ 中（图 1A、B）。根据 artJ 和 argT（一种 Arg、Lys 和 Orn 结合蛋白）的晶体结构，其叶 II 的环区和铰链区在底物结合时会发生显著构象变化 [45, 46, 52-56]，这为 cpEGFP 的插入提供了潜在的位点。首先，我们在纯化蛋白上筛选了 cpEGFP 的插入位点（图 1C）。artJ 与 cpEGFP 之间的连接肽设计为柔性（Gly-Gly）或刚性（Pro-Pro）。基于初步筛选结果，我们选择了动态范围大于 0.1 的探针（图 1D）。考虑到基于蛋白纯化的筛选方法耗时较长，且在体外响应的探针在细胞环境中可能表现不同，我们转而使用 HEK293T 细胞进行筛选。通过将探针与 iSeroSnFR 的膜靶向序列融合 [57]，我们将探针靶向到人胚胎肾 293T（HEK293T）细胞的细胞膜上，以优化连接肽的长度和氨基酸组成，从而最小化细胞内 Arg 对探针响应的影响。我们发现，在 HEK293T 细胞膜上表现出良好响应的探针的响应值分别为 0.4 和 0.6，分别命名为 ArgS0.1 和 ArgS0.2（图 1C、D，图 S1C）。随后，我们优化了连接肽邻近位点，发现响应最佳的探针的响应值为 0.9，命名为 ArgS1（图 1D，图 S1C）。总结而言，通过对 1200 多种不同变体的筛选，我们最终确定了三种探针，分别命名为 ArgS0.1、ArgS0.2 和 ArgS1（图 1D）。

我们将这三种探针分别在大肠杆菌中表达并纯化，随后测试了它们对各种氨基酸的特异性。结果显示，所有三种 ArgS 探针均特异性地响应 L-Arg，而对其他氨基酸的 L 型或 D 型均无响应（图 1E，图 S2A、B）。这三种 ArgS 探针均表现出比率特性，具有两个激发峰（分别位于 400 纳米（nm）和 500 nm 附近）和一个发射峰（位于 515 nm 附近）。当与 1 mM Arg 结合时，三种探针的 400nm 激发峰降低，而 500nm 激发峰增加（图 1F，图 S2C、D）。我们还测量了 ArgS0.1、ArgS0.2 和 ArgS1 的 Arg 结合亲和力，其 Kd 值分别为 73μM、367μM 和 1141μM，荧光峰值变化（ΔR/R0）分别为 1.9、4.6 和 19（图 1 G，图 S2E、F）。同时，我们评估了 ArgS 探针对精氨酸相关代谢物的特异性。ArgS0.1 对胍丁胺、Cit 和精氨琥珀酸表现出可检测的响应，而 ArgS0.2 和 ArgS1 仅对 Cit 和精氨琥珀酸有响应（图 S3A、D、G）。在瓜氨酸（Cit）结合实验中，ArgS0.1、ArgS0.2 和 ArgS1 的 Kd 分别为 312 μM、1162 μM 和 2912 μM，其荧光峰值变化约为 Arg 的一半（图 S3B、E、H）。对于精氨琥珀酸的结合，所有探针的 Kd 值均超过 300 μM（图 S3C、F、G）。为了减少 Arg 相关代谢物的潜在干扰，我们通过 LC-MS 定量分析了 HEK293T 和 MDA-MB-231 细胞中这些代谢物的细胞内浓度。在两种细胞系中，Cit 和精氨琥珀酸的浓度均低于 5 μM（HEK293T 细胞中 Cit 为 1.290 μM，MDA-MB-231 细胞中 Cit 为 3.920 μM；HEK293T 细胞中精氨琥珀酸为 1.556 μM，MDA-MB-231 细胞中精氨琥珀酸为 4.156 μM），均低于 ArgS 探针的检测阈值（图 S3J）。因此，在检测 HEK293T 或 MDA-MB-231 细胞中的 Arg 水平时，Cit 或精氨琥珀酸的潜在干扰可忽略不计。此外，基于嗜热脂肪土芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）artJ 的晶体结构 [45]，我们开发了三种 ArgS1 探针的突变版本。其中，双点突变版本 ArgS1-F51L E114L 对 Arg 几乎无响应（图 S4C）。因此，该版本探针 ArgS1-F51L E114L 被命名为 ArgS1-C，并作为后续实验的对照。为了研究 pH 依赖性，我们在 pH 4 至 9 的范围内测试了 ArgS1 和 ArgS1-C。ArgS1 在 pH 7 至 8 之间对 Arg 的响应最佳（图 S4A），而 ArgS1 和 ArgS1-C 的 apo 形式在整个测试范围内表现出相似的 pH 依赖性行为（图 S4B）。

Arg 探针在 HEK293T 细胞质及亚细胞器中检测 Arg 变化

为了研究 Arg 探针是否能够在哺乳动物细胞中检测 Arg，我们在 HEK293T 细胞的细胞质中表达了 ArgS0.1、ArgS0.2 和 ArgS1（图 2A）。Arg 转运蛋白 SLC7A1[58] 和 SLC7A2[59] 在 HEK293T 细胞中高表达（图 S5A）。当细胞外 Arg 浓度升高至 1 mM 时，我们立即观察到 ArgS1、ArgS0.1 和 ArgS0.2 在 405 nm 处的荧光强度下降，而在 488 nm 处的荧光强度增加（图 2B，图 S6A）。这表明所有三种探针（ArgS1、ArgS0.1 和 ArgS0.2）均对 Arg 的增加作出了响应，其最大动态范围分别为 3.3、0.3 和 1.1（图 2D，图 S6D、E）。当 Arg 探针达到其峰值动态范围后，我们将灌注液切换回磷酸盐缓冲液（PBS），观察到三种探针在 405 nm 处的荧光强度立即增加，而在 488 nm 处的荧光强度下降，其响应恢复到基线值（图 2C，图 S6B、C）。

为了在 HEK293T 细胞质中进行原位滴定以测量 ArgS1 的 Arg 结合亲和力，我们用毛地黄皂苷（digitonin）透化细胞膜，并向细胞中添加不同浓度（1 至 ∼60000 μM）的 Arg（图 S5B）。通过绘制表达 ArgS1 的细胞平均响应与 Arg 浓度的关系，获得了原位校准曲线。因此，我们测量了 ArgS1 在 HEK293T 细胞质中的 Arg 结合亲和力，其 Kd 值为 64 μM（图 2E）。此外，为了最小化非特异性荧光信号变化，我们在 HEK293T 细胞中表达了非结合对照探针 ArgS1-C。如图 S5D 所示，ArgS1-C 对 1 mM Arg 灌注无响应。

为了确定 Arg 探针是否能够检测由药物干预引起的 HEK293T 细胞中 Arg 的变化，我们在这些细胞中表达了 ArgS1。我们利用精氨酸酶 I 和 II 抑制剂（Arginase Inhibitor 1, AI1）[60] 和一氧化氮合酶（NOS）抑制剂 L-NMMA[61-65] 来调控 Arg 水平。如图 2F 所示，使用 ArgS1 检测到 AI1 或 AI1 与 L-NMMA 联合应用引起的细胞内 Arg 水平升高；然而，单独使用 L-NMMA 并未诱导类似的响应。这些结果表明，在 HEK293T 细胞中，精氨酸酶途径在 Arg 降解中的作用比 NOS 途径更为重要。这一结论与我们的转录组测序结果一致。在 HEK293T 细胞内，ARG2 的表达水平最高，而 ARG1 和 NOS2 的表达水平非常低，NOS1 则未表达（图 S5C）。因此，ArgS1 探针有效地监测了 HEK293T 细胞中药理干预引起的 Arg 浓度变化。

为了进一步研究 Arg 探针是否能够响应亚细胞器中的 Arg，我们将 ArgS1（图 3）和 ArgS0.1（图 S7）靶向到不同的细胞器。我们将 ArgS1 和 ArgS0.1 分别与 AKAP1 的 N 端 30 个氨基酸引导序列 [66]、p450 的内质网（ER）靶向基序 [67]、LAMP1 衍生的序列 [68] 或核定位信号 [69] 融合，以定位到线粒体胞质侧（Mito-ArgS1 和 Mito-ArgS0.1）、ER 胞质侧（ER-ArgS1 和 ER-ArgS0.1）、溶酶体（Lyso-ArgS1 和 Lyso-ArgS0.1）或细胞核（Nuc-ArgS1 和 Nuc-ArgS0.1）（图 3A）。为了评估 ArgS1 在线粒体、ER、溶酶体和细胞核中的定位，我们分别使用 Mito-Tracker、ER-Tracker、Lyso-Tracker 和 NucRed 作为对照。结果显示，ArgS 探针与相应的细胞器标记物高度共定位（图 3B，图 S7A）。当向培养 HEK293T 细胞的培养基中灌注 1 mM Arg 时，定位在细胞器中的 ArgS 探针也对 Arg 水平的变化作出了响应（图 3C-F，图 S7B-E）。Mito-ArgS1、ER-ArgS1、Lyso-ArgS1 和 Nuc-ArgS1 探针的最大动态范围分别为 3.7、3.8、3.2 和 3.8（图 3 G-J），而 Mito-ArgS0.1、ER-ArgS0.1、Lyso-ArgS0.1 和 Nuc-ArgS0.1 探针的最大动态范围分别为 0.5、0.5、0.4 和 0.6（图 S7F-I）。这些结果表明，ArgS 探针在线粒体、ER 和溶酶体附近区域以及细胞核内的响应相似。因此，我们成功开发了能够监测哺乳动物细胞质和亚细胞器中 Arg 的 ArgS 探针。

细胞外 Arg 剥夺导致癌细胞细胞内 Arg 水平下降

Arg 饥饿正被探索为一种针对 ASS1 缺陷型癌症的潜在治疗策略 [28, 70]（图 4A）。据报道，乳腺癌细胞系 MDA-MB-231 不表达 ASS1[28]（图 4B）。我们首先验证了 Arg 剥夺对细胞活力的影响。Arg 剥夺 24 小时后，MDA-MB-231 细胞的活力下降（图 4C），这与之前的报道一致 [28]。此外，过表达 ASS1 能够回补 MDA-MB-231 细胞对 Arg 饥饿的敏感性（图 4B、C）。为了观察细胞内 Arg 水平，我们开发了在 MDA-MB-231 细胞中稳定表达 ArgS1 的细胞系（图 4A）。我们发现，Arg 剥夺后，ArgS1 探针的 488/405 比率及其衰减速率均显著下降，表明 MDA-MB-231 细胞内的 Arg 水平显著低于对照组（图 4D、E，图 S8B）。此外，Arg 剥夺后，ASS1 过表达组的 488/405 比率高于 ASS1 缺陷组，表明通过 ASS1 过表达回补了 Arg 水平（图 4D、E）。此外，为了进一步减少非特异性荧光信号变化，我们在 MDA-MB-231 细胞中表达了 ArgS1-C。如图 S8A 所示，ArgS1-C 对 1 mM Arg 灌注也无响应。因此，ArgS1 探针可用于监测癌细胞中的 Arg 水平。

🔹 讨论 🔹

为了将 ArgS 探针与其他 Arg 探针进行比较，我们整理了各种 Arg 探针的特性，如表 S1 所示。例如，基于 glnH 的 QBP/Citrine/ECFP 探针对 Arg 的 Kd 为 2.1 mM，动态范围为 0.3[39]。此外，基于 argT 的 FLIP-cpargT194 探针对 Arg 的 Kd 为 48 μM，动态范围为 0.5[40]。然而，这些探针并非对 Arg 完全特异：QBP/Citrine/ECFP 还对 Orn 有响应，而 FLIP-cpargT194 对 Orn 和 Lys 均有响应 [39, 40]。相比之下，FLIP-cpartJ185 和 FLIPR 探针对 Arg 具有特异性，其 Kd 值分别为 9.4 μM 和 14 μM，动态范围分别为 0.5 和 0.3[40, 41]。由于这些探针对 Arg 的响应和特异性有限，它们并不适合检测哺乳动物细胞内 Arg 浓度的变化。相比之下，ArgS 探针 ——ArgS0.1、ArgS0.2 和 ArgS1 的 Kd 值分别为 73 μM、367 μM 和 1141 μM，荧光峰值变化（ΔR/R0）分别为 1.9、4.6 和 19。这些响应优于以往的 Arg 探针，且 ArgS 探针特异性地响应 Arg，而不会与其他氨基酸发生交叉反应。最近，研究人员报道了一种名为 STAR 的基因编码探针，它特异性地响应 Arg，并能够在体外和体内监测 Arg 动态 [71]。与 STAR 相比，ArgS1 的荧光响应略大（ΔR/R0：19 vs. ～16，体外）。然而，与 ArgS1 不同，STAR 不具备比率特性，因此需要额外的对照来校正探针表达水平的变化。

为了增强 ArgS 探针的最大响应，我们筛选了不同长度和组成的连接肽。结果表明，N 端连接肽为 2 或 3 个氨基酸、C 端连接肽为 2 个氨基酸时，响应更大，且 N 端连接肽的首个氨基酸优选为 Gly。此外，在筛选过程的第 4 步中，测试了 N 端连接肽邻近的氨基酸残基。例如，将该残基替换为 Ile 显著提高了响应，从而开发出了 ArgS1。尽管我们筛选了 1200 多个候选变体，但通过进一步扩展筛选范围以包括更多邻近连接肽位点，仍有可能实现进一步改进。

具体而言，HEK293T 细胞质中的 ArgS1 的 Kd 值为 64 μM，高于体外测量的值。类似地，iGluSnFR 探针在 HEK293T 细胞或培养的海马神经元中的亲和力也高于体外观察到的值 [47, 49, 72]。这种差异可能是由于蛋白质在不同环境和检测系统中的暴露差异，也可能是细胞环境中的辅助因子增强了 Arg 结合的结果。然而，即使在体外实验中加入细胞裂解液后，测得的 Kd 仍处于毫摩尔范围，这表明需要进一步研究。因此，为了准确量化不同环境中的 Arg 水平，应在多种实验条件下测量 Kd 以考虑这些因素。此外，ArgS1 对 Cit 和精氨琥珀酸表现出可检测的响应。在测量不同生物环境中的 Arg 水平时，必须确保 Cit 和精氨琥珀酸的浓度低于 ArgS1 探针的检测阈值。

关于 ArgS 探针在不同亚细胞位置的动态特性，Nuc-ArgS1 和 ER-ArgS1 的 Arg 灌注时间比其他位置短，这可能反映了亚细胞间 Arg 代谢的差异（图 3C-F）。此外，我们尝试确定每个亚细胞位置的基线 Arg 浓度；然而，我们不确定灌注前的初始比率是否准确反映了基线浓度，因为探针游离形式的荧光比率可能在不同亚细胞区室中有所不同。此外，在每个亚细胞位置除去 Arg 以获得 ArgS 探针的游离形式具有挑战性。因此，我们选择在获得更可靠的方法来获取这些区室中 ArgS 探针的游离形式之前，不对亚细胞位置的 Arg 浓度进行量化。

Arg 在生理和病理过程中发挥着关键作用；然而，其许多功能仍未得到充分理解。例如，星形胶质细胞和神经元之间 Arg 转运的机制尚不清楚，其作为信号分子的作用也未明确定义。此外，Arg 浓度的变化可以与其他分子（如 Ca²⁺、cAMP 和 Glu）一起使用互补的荧光探针进行监测。我们希望 ArgS 探针能够有助于阐明 Arg 代谢的机制，并为其生理和病理作用提供更深入的见解。

🔹 结论 🔹

总之，ArgS1 能够实时检测多种哺乳动物细胞中 Arg 水平的变化，为基础研究和临床应用提供了宝贵的工具。这是首个能够动态监测哺乳动物细胞内 Arg 浓度变化的基因编码荧光探针。此外，ArgS1 在亚细胞器中对 Arg 表现出动态响应，并已成功用于监测 MDA-MB-231 乳腺癌细胞中的 Arg 水平。

🔹 致谢 🔹

ACS Sensors：饶毅团队开发一种用于精氨酸的基因编码探针

正文

请到「今天看啥」查看全文