Science：脊髓损伤后的神经再生重大突破

生信人 · 公众号 · 生物 · 2025-03-08 07:02

正文

今天介绍的的文章是 Recovery of walking after paralysis by regenerating characterized neurons to their natural target region，于 2023年9月发表在Science（IF=56.9） 上，本文由瑞士联邦理工学院（EPFL）生命科学学院NeuroX研究所的Courtine, Gregoire 和Anderson, Mark A.联合发表，是之前大部分横断型脊髓损伤模型后无法实现功能恢复[1-4]的重要工作延续。

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以神经元轴突再生为导向的研究是目前脊髓损伤领域大部分干预手段的最终目的，作者之前的干预手段[1]是用骨桥蛋白、胰岛素样生长因子1和睫状体源性神经营养因子重新激活成熟的下行脊髓固有神经元的生长能力，然后用成纤维细胞生长因子2和表皮生长因子诱导SCI前的生长支持基质；和具有胶质源性神经营养因子的化学吸引的脊髓本体轴突，所述胶质源性神经营养因子通过从生物材料库的空间和时间控制释放递送，在SCI之后依次放置。这样的治疗手段使得损伤头段的神经纤维生长过了损伤区，但这样的治疗效果没有行为学恢复，这是作者这篇研究重要的科学问题。

我们从作者的角度简单梳理一下文章的结构，为何作者的这样的治疗手段实现了轴突再生却不能有行为恢复呢，作者借鉴了不完全脊髓损伤模型的原理。脊髓损伤模型包括挫伤、交替损伤、离断、部分离断、移除等多种模型，这些模型中挫伤、交替损伤、部分离断模型是不完全脊髓损伤，在手术造模后都会自行恢复（部分）行走，其根本原因已被较多研究证明是脊髓中的其他神经元所代偿，但离断模型会彻底破坏脊髓灰质白质中的所有结构，导致小鼠无法自行恢复，因此，产生了一种治疗思路， 找到何种神经元的再生对代偿有贡献，再生到什么水平有贡献。

何种神经元在不完全脊髓损伤中代偿呢？作者采用病毒注射观察正常情况和不完全脊髓损伤情况下哪些神经元的轴突投射到负责后肢行走的脊髓运动神经元，发现主要是腰段的某一种类型的神经元，为了了解该类型神经元的身份，作者拟采用snRNA-seq（对神经元的保护好）技术解决，但这里出现了一个目前神经科学领域研究的一大难题：神经元无法被分选，而作者的解决方法非常优秀，采用的病毒荧光是表达在核膜之上（KASH-eGFP），通过这样的手段，作者把要被分选的神经元的荧光标记在了核上，因此作者在后续操作中并非常规分选后测序的流程（解离-分选-上机），而是先进行抽核-分选细胞核-上机snRNA-seq，这样对细胞核分选要比神经元分选安全的多，作者用这样的方式成功富集到了荧光目的细胞，发现投射到负责后肢行走的脊髓运动神经元主要是VSX2+的神经元，作者将其命名SCVsx2::Hoxa7::Zfhx3→lumbar，我们观察他的snRNA-seq结果可以看到并不是分选的结果中都是eGFP+，但是我们可以想象如果取整个组织不分选直接进行snRNA-seq可能检测到的细胞更加稀少。这是一个方法学的创新，也是本文的突出贡献之一，这篇文章的作者之一，是哈佛大学的何志刚教授，何志刚教授也采用同样的方法进行了测序获得了重要的成果[5]。

之后作者采用IF结合病毒分析了正常情况下SCVsx2::Hoxa7::Zfhx3→lumbar神经元的解剖特点。Vsx2神经元的投影特征：通过病毒追踪技术，研究者们确定了Vsx2神经元在胸髓中的分布，并观察到它们 向腰髓的密集投影 ，这表明这些神经元在行走功能中扮演着重要角色。Zfhx3的共定位：研究者们发现Zfhx3与Vsx2在向腰髓投射的神经元中共定位，表明这一特定神经元亚群具有 长距离投射 的能力。vGi神经元的连接：通过顺行病毒追踪，研究者们揭示了腹侧 巨大细胞核（vGi）神经元 与Vsx2阳性神经元之间的连接，这些连接对于行走功能的恢复至关重要。这里会有一个疑问，为何连接这个核团能够帮助恢复行走，行走不应该是运动皮层发出的指令吗？这个问题已经在通讯作者Courtine Gregoire的既往工作[6]中回答了，这样的代偿机制是损伤后运动皮层到vGi核团的投射变多。

作者再一次使用他们的再生策略：用骨桥蛋白、胰岛素样生长因子1和睫状体源性神经营养因子重新激活成熟的下行脊髓固有神经元的生长能力，然后用成纤维细胞生长因子2和表皮生长因子诱导SCI前的生长支持基质；和具有胶质源性神经营养因子的化学吸引的脊髓本体轴突，所述胶质源性神经营养因子通过从生物材料库的空间和时间控制释放递送，在SCI之后依次放置。但这样的策略只能让轴突再生一段距离，不足以到达SCVsx2::Hoxa7::Zfhx3→lumbar神经元的正常解剖位置即负责行走的腰段，所以作者将下端的具有胶质源性神经营养因子的化学吸引改成慢病毒持续表达GDNF，通过这样的策略，轴突到达了解剖目的地，恢复了行走，并且作者用结果一的方法继续测序，发现再生的轴突仍然是SCVsx2::Hoxa7::Zfhx3→lumbar。

之后作者做了一系列行为学研究，比较套路，但是说服力很强，我们可以借鉴：

研究者们展示了一种基于机制的组合再生策略的 行为学恢复，及其数据的量化 ；Vsx2阳性神经元的必要性验证：通过在 Vsx2Cre小鼠中表达白喉毒素受体（DTR） ，研究者们特异性地消融了胸髓中的Vsx2阳性神经元，并观察到这些小鼠在再生策略后行走功能的丧失，证实了这些神经元在行走功能恢复中的必要性。为什么做了DTR还要在做化学遗传呢？因为Vsx2+的细胞部分有轴突再生，有一部分可能没有再生，这一部分有没有贡献没法判断，但是在 DTR消融实验中他们都被干掉了 （Vsx2+且有轴突再生的神经元和Vsx2+没有轴突再生的神经元），因此作者继续做特定类型的Vsx2+神经元的失活：研究者们设计了一种交叉化学遗传策略，通过在小鼠中注射特定的 化学遗传病毒载体 ，能够在小鼠行走功能显著恢复后，特异性地沉默再生的Vsx2阳性神经元。当这些神经元被失活后，小鼠的行走功能再次受损。在进行了再生策略的小鼠中，研究者们观察到了与自然修复过程相似的行走模式，这表明再生策略有效地促进了行走功能的恢复。 最后整体水平的验证 ：通过微刺激腹侧巨大细胞核（vGi）并记录腿部肌肉的运动诱发电位，研究者们证实了再生的轴突能够恢复脊髓损伤后大脑对下肢功能的控制。

这篇文章就脊髓损伤研究领域而言，该研究解答了之前以‘神经元轴突再生’为主要治疗目的的研究为何无法实现了后肢运动的原因，为‘神经元轴突再生’类型的研究提供了治疗靶细胞及再生的目的地。

就实验方法而言，该研究结合病毒荧光标记、流式分选及单细胞核测序方法实现了神经元分选后测序的重要难点，既往神经科学领域无法通过荧光或者抗体进行流式分选神经元，具体原因与其特殊的解剖结构有关，而目前很多研究都期待分选目的神经元，该研究提供了一个简单可行的方法，同时该研究也衍生了另一篇文章，2023年12月发表于Nature的研究，该研究为脊髓损伤领域顶级科学家何志刚完成，采用同样的方法解析了所有的脊髓投射类型的神经元及其投射位置。该研究提供了一项及其重要的神经科学领域的测序方法，使神经元分选测序成为了可能！

参考文献：

1. P. Lu et al., Cell 150, 1264–1273 (2012).

2 . G. H. D. Poplawski et al., Nature 581, 77–82 (2020).

3. G. Kong et al., Nat. Metab. 2, 918–933 (2020).

4. B. J. Hilton et al., Neuron 110, 51–69.e7 (2022).

5. C.C. Winter et al., Nature 624, 403-414(2023).

6. L. Asboth et al., Nature Neuroscience 21, 576-588(2018).

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