mRNA疫苗纠结曲折的发展史

在新冠病毒大流行带来突破之前，数百名科学家已经在mRNA 疫苗上研究了数十载。随着mRNA疫苗获得2023年的诺贝尔奖，有必要花点时间了解一下相关的发展历史和背后的故事。

自然杂志Elie Dolgin所发表的文章（2021 年 9 月 14 日）很好的总结了这一主题，故本文翻译了这篇文章，分享供读史参考。

辉瑞和 BioNTech 开发的 COVID-19 疫苗中使用的 RNA 序列（ Ψ 是尿苷酸 U 的修饰形式）。

1987 年底， Robert Malone （罗伯特 · 马龙）进行了一项里程碑式的实验。他将信使 RNA 链与脂肪滴混合，创造出一种分子混合物。沉浸在这种混合物中的人体细胞吸收了 mRNA ，并开始从中产生蛋白质 。

意识到这一发现可能在医学上具有深远的潜力后，加利福尼亚州拉霍亚 Salk 索尔克生物研究所的研究生 Malone 记下了一些笔记，并在上面签名注明了日期。他在 1988 年 1 月 11 日写道，如果细胞能够从传递给它们的 mRNA 中产生蛋白质，那么 “ 将 RNA 视为一种药物 ” 是可能的。索尔克实验室的另一名成员也为后世在笔记上签了名。那年晚些时候， Malone 的实验表明青蛙胚胎吸收了这种 mRNA 。这是第一次有人使用脂肪滴使得 mRNA 进入生物体的过程更加容易。

这些实验是迈向历史上两种最重要和最有利可图的疫苗的垫脚石： 为全球数亿人提供 的 COVID-19 mRNA 疫苗。仅在 2021 年，这些疫苗的全球销售额预计将超过 500 亿美元。

但通往成功的道路并不是那么直接的。在马龙实验（本身也是借鉴其他人的研究工作）之后多年，人们认为 mRNA 太不稳定且价格昂贵，无法用作药物或疫苗。数十个科研实验室和公司致力于研究，努力寻找正确的脂肪和核酸配方（构建 mRNA 疫苗的基石）。

今天的 mRNA 疫苗注射具有创新，这些创新是在马龙实验室工作多年后发明的，包括化学修饰的 RNA 分子和不同类型的脂肪泡以将它们运送到细胞中（参见 “mRNA COVID 疫苗内部 ” ）。尽管如此，自称为 “mRNA 疫苗发明者 ” 的马龙认为他的工作没有得到足够的认可。 “ 我已经被历史遗忘了， ” 他告诉《 自然 》杂志。

改编自 MD Buschmann 等人，疫苗 9 , 65 (2021)

随着各类奖项开始颁发，关于谁应该因开创这项技术而得到荣誉的争论正在升温 —— 而且在诺贝尔奖马上公布之前，这种猜测变得更加激烈。但仅限于少数科学家获奖的正式奖项将无法认可 mRNA 医学发展过程中的众多贡献者。实际上，通往 mRNA 疫苗的道路借鉴了数百名研究人员 30 多年来的工作成果。

这个故事也阐明了许多科学发现成为改变生活的创新产品的方式：走数十年的死胡同、被拒和争夺潜在利润的斗争，但也有慷慨、好奇和对疑问和置疑的固执坚持。 “ 这是一系列漫长的步骤， ” 图森市亚利桑那大学的发育生物学家 Paul Krieg （保罗 · 克里格）说，他在 1980 年代中期做出了自己的贡献， “ 而且你永远不知道什么会有用 ” 。

mRNA 的起源

马龙的实验并非凭空而来。早在 1978 年，科学家们就已经使用称为脂质体的脂质膜结构将 mRNA 转运到小鼠 和人类 细胞中以诱导蛋白质表达。脂质体包装并保护 mRNA ，与细胞膜融合后将遗传物质输送到细胞中。这些实验本身建立在脂质体和 mRNA 的多年工作基础上，两者都是在 1960 年代发现的（参见 “mRNA 疫苗的历史 ” ）。

改编自 U. Şahin 等人。 Nature Rev. Drug Discov. 13 , 759–780 (2014) 和 X. Hou 等人。 Nature Rev. Mater. https://doi.org/gmjsn5（2021 年）。

然而，当时很少有研究人员将 mRNA 视为一种医学产品 —— 尤其是因为当时还没有一种方法可以在实验室中制造这种遗传物质。相反，他们希望用它来研究基本的分子过程。大多数科学家会使用兔血、培养的小鼠细胞或其他一些动物来源的 mRNA 。

这种情况在 1984 年发生了变化，当时 Krieg 和由发育生物学家 Douglas Melton 以及分子生物学家 Tom Maniatis 和 Michael Green 领导的团队的其他成员在哈佛大学使用了一种 RNA 合成酶（取自病毒）和其他工具在实验室中 生产具有生物活性的 mRNA （这种方法的核心至今仍在使用）。 Krieg 然后将实验室制造的 mRNA 注射到青蛙卵中，并表明它与真实的 mRNA 分子一样有效 。

Melton 和 Krieg 都表示，他们将合成 mRNA 主要视为研究基因功能和活性的研究工具。 1987 年，在 Melton 发现 mRNA 既可以用于激活也可以阻止蛋白质的产生之后，他帮助成立了一家名为 Oligogen 的公司（后来在加利福尼亚州福斯特市更名为吉利德科学），以探索使用合成 RNA 来阻止目标基因的表达 —— 着眼于治疗疾病。他实验室里的任何人或他们的合作者都没有想到用于疫苗。

Paul Krieg （左）和 Douglas Melton （右），他们在实验室研究合成 mRNA 的方法。

“ 总的来说， RNA 具有令人难以置信的不稳定性， ”Krieg 说。 “RNA 周围的一切都被谨慎地掩盖了。 ” 这或许可以解释为什么哈佛的技术开发办公室选择不为该组织的 RNA 合成方法申请专利。相反，哈佛大学的研究人员只是将他们的试剂提供给了威斯康星州麦迪逊市的一家实验室试剂耗材公司 Promega ，该公司为研究人员提供了 RNA 合成工具。作为回报，他们获得了适度的特许权使用费和一箱凯歌香槟（ Veuve Clicquot Champagne ）。

专利纠纷

多年后， Malone 按照哈佛团队的策略为他的实验合成了 mRNA 。但他添加了一种带正电荷的新型脂质体，这增强了脂质体材料与 mRNA 带负电荷的骨架相结合的能力。这些脂质体由 Philip Felgner 开发，他是一位生物化学家，他现在是加州大学尔湾分校疫苗研发中心的负责人。

Philip Felgner （ 菲利普 · 费尔格纳，左）和 Robert Malone （ 罗伯特 · 马龙）。

尽管他成功地使用脂质体将 mRNA 递送到人类细胞和青蛙胚胎中，但马龙从未获得博士学位。他与他的导师、 Salk 基因治疗研究员 Inder Verma 闹翻，并于 1989 年提早离开研究生学习，在加利福尼亚州圣地亚哥成立的初创公司 Vical 为 Felgner 工作。在那里，他们和威斯康星大学麦迪逊分校的合作者表明，脂质体 -mRNA 复合物可以刺激小鼠的蛋白质生成 。

罗伯特 · 马龙实验室笔记本的摘录，描述了 1989 年合成的 mRNA 用于注射到小鼠体内。

然后事情变得一团糟。 Vical （与威斯康星大学合作）和 Salk 于 1989 年 3 月开始申请专利。但 Salk 很快放弃了其专利声明， Verma 于 1990 年加入了 Vical 的顾问委员会。

马龙辩称， Verma 和 Vical 达成了一项幕后交易，因此相关知识产权归 Vical 所有。马龙被列为众多发明家之一，但他个人不再像其他 Salk 的任何专利一样可以从随后的许可交易中获利。马龙的结论是： “ 他们靠我构思的产品发财了。 ”

Verma 和 Felgner 断然否认马龙的指控。 “ 这完全是胡说八道， ” Verma 告诉《 自然 》杂志。他说，放弃专利申请的决定取决于 Salk 的技术转让办公室。（ Verma 在性骚扰指控 后于 2018 年从索尔克辞职，尽管他一直否认。）

马龙于 1989 年 8 月离开 Vical ，理由是与 Felgner 在 “ 科学判断 ” 和 “ 我的智力贡献的功劳 ” 上存在分歧。他完成了医学院的学业并接受了一年的临床培训，然后在学术界工作，在那里他试图继续研究 mRNA 疫苗，但难以获得资金。（例如， 1996 年，他向加利福尼亚州的一家研究机构申请资金开发一种 mRNA 疫苗来对抗季节性冠状病毒感染，但没有成功。）相反，马龙专注于 DNA 疫苗和递送技术。

2001 年，他开始从事商业工作和咨询工作。在过去的几个月里，他开始公开抨击他的研究帮助实现的 mRNA 疫苗的安全性。例如，马龙说，疫苗产生的蛋白质会损害人体细胞，对儿童和年轻人而言接种疫苗的风险超过其好处 —— 其他科学家和卫生官员一再反驳这种说法。

制造的挑战

1991 年， Vical 与美国默克公司（世界上最大的疫苗开发商之一）签订了一项价值数百万美元的研究合作和许可协议。默克的科学家们在小鼠身上评估了 mRNA 技术，目的是创造一种流感疫苗，但后来放弃了这种方法。 “ 制造的成本和可行性让我们停下了脚步， ” 前默克科学家杰弗里 · 乌尔默 (Jeffrey Ulmer) 说，他现在向其他公司提供疫苗研究问题方面的咨询。

法国斯特拉斯堡一家名为 Transgène 的小型生物技术公司的研究人员也有同样的感受。 1993 年，由 Pierre Meulien 领导的团队与工业和学术伙伴合作，首次证明脂质体中的 mRNA 可以在小鼠中引发特定的抗病毒免疫反应 。（另一个激动人心的进展出现在 1992 年，当时拉霍亚斯 scripps 克里普斯研究所的科学家们使用 mRNA 替换了大鼠体内的一种缺陷蛋白，以治疗代谢紊乱 。但这离独立实验室报告类似的成功结果还需要近 20 年的时间。）

Pierre Meulien （ 皮埃尔 · 梅利安）。

Transgène 研究人员为他们的发明申请了专利，并继续研究 mRNA 疫苗。但现任布鲁塞尔公私企业创新药物计划负责人的 Meulien 估计，他至少需要 1 亿欧元（ 1.19 亿美元）来优化该平台 —— 而且他说，对于这样一个 “ 棘手、高风险 ” 的冒险，他不打算向他的老板提出那么多要求。在 Transgène 的母公司决定停止支付保持项目进展所需的费用后，该专利失效。

与默克团队一样， Meulien 的团队转而专注于 DNA 疫苗和其他基于载体的递送系统。 DNA 平台最终产生了一些用于兽医应用的许可疫苗 —— 例如，有助于预防养鱼场的感染。就在上个月， 印度监管机构紧急批准了世界上第一种供人类使用的 DNA 疫苗，以帮助抵御 COVID-19。但由于尚未完全了解到的原因，DNA 疫苗在人体中进展很慢。

不过， Ulmer 认为，该行业围绕 DNA 技术的一致推动也为 RNA 疫苗带来了好处。他说，从制造考虑和监管经验到序列设计和分子洞察力， “ 我们从 DNA 中学到的许多东西都可以直接应用于 RNA” 。 “ 它为 RNA 的成功奠定了基础。 ”

持续的斗争

在 1990 年代和 2000 年代的大部分时间里，几乎所有考虑研究 mRNA 的疫苗公司都选择将其资源投到了其他地方。传统观点认为 mRNA 太容易降解，其生产成本太高。 “ 这是一场持续的斗争， ” 斯德哥尔摩卡罗林斯卡研究所的病毒学家 Peter Liljeström 说，他在 30 年前率先开发了一种 “ 自我放大 ” 的 RNA 疫苗。

“ 在 RNA 上开展工作太难了， ” 马特 · 温克勒 (Matt Winkler) 说，他于 1989 年在德克萨斯州奥斯汀创立了第一家专注于 RNA 的实验室试剂耗材公司之一 Ambion 。 “ 如果你当时问我是否可以将 RNA 注射到某人体内以获得疫苗，我会当着你的面笑话你。 ”

mRNA 疫苗的想法在肿瘤学界更受欢迎，尽管它是作为一种治疗方法，而不是预防疾病。从基因治疗师 David Curiel 的工作开始，几位科学家和初创公司探索了 mRNA 是否可用于对抗癌症。如果 mRNA 编码了癌细胞表达的蛋白质，那么想法是可将其注射到体内可能会训练免疫系统攻击这些细胞。

Curiel （现任职密苏里州圣路易斯的华盛顿大学医学院）在老鼠身上取得了一些成功 。但他说，当他就商业化机会与 Ambion 接洽时，该公司告诉他： “ 我们认为这项技术没有任何经济潜力。 ”

另一位癌症免疫学家取得了更大的成功，这引导了 1997 年第一家 mRNA 治疗公司的成立。 Eli Gilboa 提议从血液中提取免疫细胞，并诱使它们摄取合成的 mRNA 以编码肿瘤蛋白。然后将这些细胞注射回体内，在那里它们可以调动免疫系统来攻击潜伏的肿瘤细胞。

Gilboa 和他在杜克大学医学中心的同事在小鼠身上证明了这一点 。到 1990 年代后期，学术合作者们启动了人体试验， Gilboa 的商业孵化公司 Merix Bioscience （后来更名为 Argos Therapeutics ，现在称为 CoImmune ）很快就开展了自己的临床研究。直到几年前，这种方法看起来都很有希望，但当候选疫苗在后期大型试验中失败了，它基本上就过时了。

但 Gilboa 的工作产生了重要的影响，它激励了德国公司 CureVac 和 BioNTech （当今最大的两家 mRNA 公司）的创始人们开始研究 mRNA 。 CureVac 的 Ingmar Hoerr 和 BioNTech 的 Uğur Şahin 都告诉《 自然》 杂志，在了解 Gilboa 所做的事情后，他们想做同样的事情，但是是将 mRNA 直接注入体内。

Ingmar Hoerr （左）创立了 CureVac ，癌症免疫学家 Eli Gilboa （右）创立了第一家 mRNA 治疗公司。

“ 这里就产生了一个滚雪球效应， ” 现在在迈阿密大学米勒医学院的 Gilboa 说。

初创公司加速成长

Hoerr 是第一个取得成功的人。他在 2000 年报告说，在德国图宾根大学期间他直接注射可以引起小鼠的免疫反应 。同年，他创建了 CureVac （也位于图宾根）。但似乎很少有科学家或投资者对此感兴趣。在一次会议上 Hoerr 展示早期小鼠数据时， “ 有一位诺贝尔奖获得者站在第一排说， ' 你在这里给我们讲的完全是狗屎 —— 完全是狗屎 ' 。 ” （霍尔拒绝透露诺贝尔奖获得者的名字。）

最终，资金还是流入了。几年之内，人体测试开始了。该公司当时的首席科学官史蒂夫 · 帕斯科洛 (Steve Pascolo) 是第一个研究对象：他给自己 注射了 mRNA ，现在他的腿上仍然有火柴头大小的白色疤痕，皮肤科医生从那里进行了穿刺活检以进行分析。不久之后，一项更正式的试验开始了，该试验涉及针对皮肤癌患者的肿瘤特异性 mRNA 。

Şahin 和他的免疫学家妻子 Özlem Türeci 也在 1990 年代后期开始研究 mRNA ，但他们创办公司的时间比 Hoerr 更长。他们研究这项技术多年，在德国美因茨约翰内斯古腾堡大学工作，获得专利、论文和研究资助后，于 2007 年向亿万富翁及投资者们推销其商业计划。 “ 如果它奏效，那将是开创性的， ”Şahin 说。最终，他获得了 1.5 亿欧元的种子资金。

Özlem Türeci （左）和 Uğur Şahin （右）共同创立了 mRNA 疫苗公司 BioNTech 。

同年，一家名为 RNARx 的初出茅庐的 mRNA 初创公司从美国政府获得了一笔小资金： 97,396 美元的小企业赞助资金。该公司的创始人、生物化学家 Katalin Karikó 和免疫学家 Drew Weissman 当时都在费城宾夕法尼亚大学（ UPenn ）工作，他们取得了现在一些人所说的关键发现：改变部分 mRNA 代码有助于合成的 mRNA 逃过细胞的先天免疫防御。

基本见解

整个 1990 年代， Karikó 一直在实验室里辛勤工作，目标是将 mRNA 转化为药物平台，尽管基金机构一直拒绝她的经费申请。 1995 年，在多次被拒之后，她被允许选择离开宾夕法尼亚大学或接受降级和减薪。她选择留下并继续她固执的追求，对马龙的操作流程 进行改进，并设法诱导细胞产生具有治疗相关性的复杂的大蛋白 。

Katalin Karikó 帮助证明了对 RNA 的化学修饰可以使该分子逃过通过身体的免疫防御。

1997 年，她开始与 Weissman 合作，后者刚刚在宾夕法尼亚大学开设了一个实验室。他们计划共同开发一种基于 mRNA 的 HIV/AIDS 疫苗。但是当 Karikó 的 mRNA 被注射到小鼠体内时，它会引发大规模的炎症反应。

她和 Weissman 很快就找到了原因：合成的 mRNA 会激发 一系列称为 Toll 样受体的免疫反应，它们充当病原体危险信号的第一反应者。 2005 年，这对科学家报告说，重新排列 mRNA 核苷酸之一尿苷上的化学键，可以产生一种称为假尿苷的类似物，这似乎可以避免身体将 mRNA 识别为敌人 。

Drew Weissman 与 Karikó 合作，共同发现了修饰 mRNA 的优势。

当时很少有科学家认识到这些修饰核苷酸的治疗价值。但科学界随后很快就意识到了它们的潜力。 2010 年 9 月，时任马萨诸塞州波士顿儿童医院的干细胞生物学家德里克 · 罗西 (Derrick Rossi) 领导的一个团队描述了如何使用修饰的 mRNA 来转化皮肤细胞（首先转化为类胚胎干细胞，然后转化为收缩的肌肉组织 ）。这一发现引起了轰动。罗西被《 时代 》杂志评为 2010 年 “ 重要人物 ” 之一。他在剑桥联合创办了一家初创公司 Moderna 。

Moderna 试图授权 UPenn 于 2006 年 申请 的 Karikó 和 Weissman 修饰 mRNA 专利，但为时已晚。在未能与 RNARx 达成许可协议后，宾夕法尼亚大学选择了快速付款。 2010 年 2 月，它授予麦迪逊一家小型实验室试剂供应商的独家专利权 -- 现在被称为 Cellscript ，该公司在这笔交易中支付了 30 万美元。它将继续从 Moderna 和 BioNTech 那里获得数亿美元的分许可费，这两家公司是第一个 COVID-19 mRNA 疫苗的原创者。两种产品都使用了修饰的 mRNA 。

与此同时， RNARx 又用完了 80 万美元的小企业赞助资金，于 2013 年停止运营，同期 Karikó 加入了 BioNTech （保留在宾夕法尼亚大学的兼职）。

假尿苷之争

研究人员仍在争论 Karikó 和 Weissman 的发现是否对成功的 mRNA 疫苗至关重要。 Moderna 一直使用经过修饰的 mRNA—— 它的名字就是这两个词的合成词。但该行业的其他一些公司却没有使用修饰的 mRNA 。

制药公司 Shire 的人类基因治疗部门的研究人员推断，如果添加正确的 “ 帽 ” 结构并去除所有杂质，未经修饰的 mRNA 可以产生同样有效的产品。 “ 这归结为 RNA 的质量， ” 迈克尔 · 哈特林 (Michael Heartlein) 说，他领导了夏尔的研究工作，并继续在剑桥的 Translate Bio 推进这项技术，夏尔后来将其 mRNA 产品组合出售给了该公司。（夏尔现在是日本武田公司的一部分。）

尽管 Translate 有一些人类数据表明其 mRNA 不会引发令人担忧的免疫反应，但其平台仍有待临床证明：其 COVID-19 候选疫苗仍处于早期人体试验阶段。法国制药巨头赛诺菲对这项技术的前景深信不疑： 2021 年 8 月，它宣布计划以 32 亿美元收购 Translate 。（ Heartlein 去年离开，在马萨诸塞州沃尔瑟姆成立了另一家公司，名为 Maritime Therapeutics 。）

与此同时， CureVac 有自己的免疫缓解策略，包括改变 mRNA 的基因序列，以最大限度地减少疫苗中的尿苷含量。这种方法近 20 年的研究似乎正在取得成果，该公司针对狂犬病 和 COVID-19 的实验性疫苗的早期试验都证明是成功的。但在今年 6 月，后期试验的数据显示 CureVac 的冠状病毒候选疫苗的 保护作用远不如 Moderna 或 BioNTech 。

鉴于这些结果，一些 mRNA 专家现在认为假尿苷是该技术的重要组成部分 —— 因此，他们说， Karikó 和 Weissman 的发现是值得认可和奖励的关键促成贡献之一。 “ 这里真正的赢家是经过修饰的 RNA ， ” 位于剑桥的合成生物学公司 Strand Therapeutics 的联合创始人兼首席执行官 Jake Becraft 说，该公司致力于基于 mRNA 的疗法。

不是每个人都那么确定。 “ 有多种因素可能会影响 mRNA 疫苗的安全性和有效性， mRNA 的化学修饰只是其中之一， ” 苏州艾博生物 Abogen Biosciences 的首席执行官英博说，该公司拥有 COVID-19 mRNA 疫苗现在处于后期临床试验阶段。（其疫苗称为 ARCoV ，该产品使用未修饰的 mRNA 。）

脂质的突破

至于关键技术的突破，许多专家强调了另一项对 mRNA 疫苗至关重要的创新，正是被称为脂质纳米颗粒或 LNP 的微小脂肪泡保护了 mRNA 并将其运送到细胞中。

这项技术来自加拿大温哥华不列颠哥伦比亚大学的生物化学家 Pieter Cullis 的实验室和他创立或领导的几家公司。从 1990 年代后期开始，他们率先将 LNP 用于传递沉默基因活动的核酸链。 Patisiran 正是一种这样的治疗方法，现在已被批准用于一种罕见的遗传性疾病。

Pieter Cullis （ 彼得 · 库利斯）。

当基因沉默疗法开始在临床试验中显示前景之后，在 2012 年， Cullis 的两家公司转向探索在基于 mRNA 的药物中使用 LNP 传递系统的机会。例如，由首席执行官 Thomas Madden 领导的温哥华 Acuitas Therapeutics 与 Weissman 在宾夕法尼亚大学的团队以及几家 mRNA 公司建立了合作伙伴关系，以测试不同的 mRNA-LNP 制剂。现在可以在 BioNTech 和 CureVac 的 COVID-19 疫苗中找到其中一种。 Moderna 的 LNP 混合物也没有太大不同。

纳米粒子是具有四种脂肪分子的混合物：三种有助于结构和稳定性，而第四种称为可电离脂质，是