在海洋环境中，污损生物在建筑和船舶等表面附着，每年都会造成巨大的经济损失和生态危害。为了抑制生物污损现象发生，通常会在船体或建筑物表面涂刷防污涂料，杀灭污损生物或减少其附着。SeaNine211是一种广谱防污剂，因其活性成分4,5-二氯-2-正辛基-4-异噻唑啉-3-酮（DCOIT）的高效和持久防污特性而被广泛使用。但DCOIT已造成了全球范围的海洋环境污染，而且对非目标生物具有高毒性，能引起内分泌干扰和繁殖毒性，威胁生态健康。研究表明DCOIT具有潜在的甲状腺内分泌干扰效应，但其致毒机制缺乏深入研究。因此，本研究综合采用
in vivo
海洋青鳉生命周期暴露、
in silico
模拟结合动力学、
in vitro
细胞暴露、
ex vivo
靶基因鉴定等多种方法，以阐明DCOIT的甲状腺内分泌干扰机制。通过海洋青鳉生命周期暴露揭示DCOIT沿下丘脑-垂体-甲状腺（HPT）轴的内分泌干扰效应；通过分子对接和生物膜层干涉技术（BLI）确定DCOIT与甲状腺激素受体（TRβ）的结合动力学；利用CUT&Tag技术分析DCOIT暴露对GH3细胞中TRβ介导信号通路的干扰。此外，我们还采用Chem-seq技术甄别DCOIT在大脑中的直接基因组DNA结合靶点。研究成果发表在
Environmental Science & Technology
，并选为副封面（图1）。
DCOIT生命周期暴露实验发现：无论雌鱼（图2A）还是雄鱼（图2B），海洋青鳉不同组织中DCOIT的生物累积量都呈现浓度依赖式增加。大脑是DCOIT的主要累积部位，并且DCOIT暴露后雌鱼的脑体指数（BSI）显著升高（图2C）。相比于对照组，10 μg/L DCOIT生命周期暴露后，雌鱼大脑的T3含量显著升高，T4含量显著降低，这导致T3/T4比值上升。在雌鱼血液中，DCOIT暴露组T3、T4的含量以浓度依赖方式显著升高（图2D）。T3/T4比值常用作甲状腺内分泌干扰的标志物，甲状腺激素失衡使T3/T4比值增加可能引起甲状腺功能亢进症状。基因表达结果显示，DCOIT生命周期暴露显著刺激雌鱼HPT轴涉及的多个调控过程，包括正反馈（
TRH
、
TRHRb
和
TSHβ
）、甲状腺激素受体介导的信号转导（
TRβ
）、激素脱碘和转化（
Dio1
、
Dio2
和
Dio3
）以及转运（
MCT8
和
SLCO1c1
）等（图3A）。
图
2
环境真实剂量
DCOIT
（
0
、
1
、
3
和
10 μg/L
）生命周期暴露后，生物累积和甲状腺激素的变化。
DCOIT
在青鳉雌鱼（
A
）和雄鱼（
B
）不同组织中的生物积累。（
C
）青鳉的
BSI
指数。青鳉雌鱼（
D
）和雄鱼（
E
）大脑、血液中的甲状腺激素含量。
图3 DCOIT生命周期暴露显著干扰海洋青鳉的HPT轴。
（A）
雌鱼；（B）雄鱼。
为深入探究DCOIT生命周期暴露对海洋青鳉甲状腺内分泌系统的干扰，分析了高浓度暴露组大脑蛋白质组的变化。值得注意的是，DCOIT暴露组雌鱼脑中显著富集与甲状腺内分泌系统相关的信号通路，如甲状腺激素代谢过程、甲状腺素5’-脱碘酶活性、甲状腺发育、甲状腺激素介导的信号通路和甲状腺激素受体结合等（图4G）。并且甲状腺相关的差异表达蛋白（DEPs）显著上调（图4H），这与基因表达结果一致。因此，DCOIT生命周期暴露显著干扰海洋青鳉甲状腺内分泌系统，并引起甲状腺功能亢进的症状，特别是雌鱼。
图
4
DCOIT
生命周期暴露显著干扰青鳉大脑蛋白表达谱
。
雌鱼（
A
）和雄鱼（
B
）蛋白质分布的火山图。（
C
）
DCOIT
暴露后丰度显著增加或者降低的
DEPs
数量。（
D
）雌雄
DEPs
的
Venn
图。（
E
）基于
DEPs
的
PCoA
。（
F
）基于雌鱼或者雄鱼
DEPs
的聚类热图。（
G
）雌鱼大脑中与甲状腺内分泌系统相关的
GO
通路。（
H
）雌鱼大脑中甲状腺内分泌
DEPs
的相关性网络图。（
I
）雄鱼大脑中显著富集的甲状腺代谢通路。（
J
）雄鱼大脑中甲状腺相关
DEPs
的倍数变化。
为揭示DCOIT干扰甲状腺内分泌系统的潜在机制，首先通过分子对接分析了DCOIT（图5A）和T3（图5B）与TRβ的相互作用。有趣的是，DCOIT和T3都能与TRβ配体结构域的ASN331和PHE272位点形成相互作用力。BLI实验证实了DCOIT与TRβ之间较强的结合能力（图5C）。此外，利用GH3大鼠垂体瘤细胞开展T-screen实验，根据细胞增殖结果判定DCOIT的TR活性。结果显示，DCOIT单独暴露或者联合T3暴露都能浓度依赖地刺激GH3细胞增殖（图5D），表明DCOIT具有和T3相似的TR激活属性。然后，分离GH3细胞的细胞质和细胞核，以测定TRβ和甲状腺激素的分布变化。Western blotting结果显示，DCOIT暴露并未引起细胞质或者细胞核中TRβ丰度的明显变化（图5E）；但是，DCOIT显著促进T3从细胞质向细胞核转移（图5F）。综上所述，分子对接、BLI和T-screen的结果共同证实了DCOIT是一种TRβ激动剂，能与甲状腺激素产生协同效应。
图5 DCOIT与TRβ结合并激活TRβ介导的信号转导。TRβ与DCOIT（A）或者T3（B）的分子对接。（C）基于BLI的DCOIT与TRβ结合动力学。（D）DCOIT单独或者联合T3暴露对GH3细胞增殖的影响。（E）DCOIT暴露后，GH3细胞质和细胞核中TRβ丰度的变化。（F）DCOIT暴露后，GH3细胞质和细胞核中T3浓度的变化。
接着，采用CUT&Tag技术探究DCOIT暴露对TRβ结合DNA靶点的干扰。KEGG和GO分析结果表明，DCOIT暴露组富集了多个与甲状腺内分泌系统相关的信号通路（图6A和C），而且DCOIT显著促进大部分甲状腺相关基因与TRβ的结合（图6B和D）。TRβ靶基因的转录水平与CUT&Tag结果基本一致。特别的是，DCOIT促进TRβ与
DIO1
启动子结合，显著上调
DIO1
的转录水平，从而促使T4向T3转化，引发甲状腺功能亢进。总之， DCOIT通过影响TRβ与下游靶基因的结合，改变基因表达，从而诱导甲状腺功能障碍。
图
6
DCOIT
改变
GH3
细胞中
TRβ
结合
的
基因组
DNA
靶点。（
A
）基于
TRβ
差异结合
DNA
片段的显著富集
KEGG
通路。（
B
）与甲状腺内分泌系统相关的
KEGG
通路差异基因网络图。（
C
）与甲状腺内分泌系统相关的
GO
过程
。（
D
）与甲状腺内分泌系统相关
的
GO
差异
基因网络图。（
E
）
DCOIT
暴露
GH3
细胞后，
CUT&Tag
结果和
qRT-PCR
结果的
一致性
比较。
此外，DCOIT共孵育后小牛胸腺DNA模板（ctDNA）的吸光度发生显著变化，证实DCOIT能直接与DNA序列结合。为进一步筛查DCOIT的基因组结合靶点，我们采用改进的Chem-seq技术，在雌鱼大脑中鉴定出与甲状腺内分泌系统反馈调节密切相关的DCOIT靶基因，即
TRHRb
和
TSHR
。同时，10 μg/L DCOIT生命周期暴露显著上调了雌鱼大脑
TRHRb
和
TSHR
的转录水平。因此，DCOIT与
TRHRb
和
TSHR
的直接结合，构成了DCOIT甲状腺内分泌干扰的另一潜在机制。
图
7
DCOIT
直接结合基因组
DNA
是甲状腺内分泌干扰的另一机制。（
A
）
DCOIT
与
ctDNA
的结合潜力。（
B
）雌雄鱼大脑中
DCOIT
结合
DNA
靶点的
Venn
图。（
C
）
DCOIT
结合的基因组元件。（
D
）雌鱼大脑中，
Chem-seq
和
qRT-PCR
结果的一致性比较。
总之，本研究综合运用
in vivo
、
in silico
、
in vitro
和
ex vivo
等方法，系统揭示了DCOIT的甲状腺内分泌干扰效应和内在机制。DCOIT生命周期暴露显著刺激海洋青鳉HPT轴，引起甲状腺功能亢进症状。DCOIT是一种TRβ激动剂，与T3产生协同效应，并且促进TRβ与下游靶基因的结合能力，改变基因表达，诱导甲状腺功能障碍。此外，DCOIT与
TRHRb
和
TSHR
的直接结合构成了DCOIT干扰甲状腺内分泌的另一条路径。研究结果为甲状腺内分泌毒理学机制提供了新的见解。鉴于DCOIT对海洋生态系统多样性和可持续性的严重威胁，未来有必要重新评估其作为防污剂的适用性，并积极寻找和开发绿色替代品。
