自催化RNA序列在自然界中普遍存在，催化包括内含子剪接、滚环病毒基因组复制以及肽键形成等多种过程。核酶是一种小的催化RNA序列，能够进行核苷酸特异性切割。目前已经鉴定出的核酶家族包括锤头病毒（Hammerhead，HH）、丁型肝炎病毒（Hepatitis delta virus，HDV）、twister等【1】。核酶介导的RNA切割会通过顺式或者反式连接形成环状RNA【2-4】。然而，线性mRNA在真核细胞中是否通过反式连接进行RNA修复尚不清楚。为此，美国罗切斯特大学Douglas M. Anderson研究组在Science上发文题为Ribozyme activated mRNA trans-ligation enables large gene delivery to treat muscular dystrophies，通过筛选核酶系统构建Stitch RNA，该系统可以激活独立mRNA的无痕反式连接和翻译形成大的融合蛋白表达来纠正肌肉营养不良。为了确定核酶能否用来在哺乳动物细胞中进行mRNA的无痕反式连接，作者们设计了表达非重叠N末端和C末端的绿色荧光蛋白报告基因。该系统中的核酶来自于HDV以及HH， 在没有同源序列的帮助下可以在HEK293T细胞中可以见到绿色荧光蛋白。但是单独转染N末端GFP与C末端GFP则未观察到绿色荧光。作者们将核酶依赖的mRNA反式连接方式称为Stitch RNA（Stitch R）（图1）。为了对Stitch RNA产生全长蛋白的数量，作者们设计了萤火虫荧光素酶（Luc）的报告基因，将Luc分为两个不重叠的部分。为了对Stitch RNA进行优化，作者们对核酶进行优化、内含子优化以及双重twiser优化最后得到了Stitch RNA 4.0。作者们尝试用Stitch RNA系统表达ACTA2编码的蛋白αSMA，在ACTA2敲除的背景下使用Stitch RNA系统可以实现αSMA蛋白。进一步地，作者们使用4个串联重复的线粒体靶向序列，会使得GFP与线粒体特异性染料MitoTracker共表达。因此，Stitch RNA系统可以实现蛋白在亚细胞水平表达。另外，作者们尝试将RFP引入Stitch RNA系统，也可以实现双色RNA反式连接表达。基因治疗中，腺病毒相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）受到AAV包装能力的影响很难表达超过4.7kb的基因。为此，作者们希望将Stitch RNA系统与AAV系统相结合克服基因治疗的局限。Dysferlin是一个237kDa的膜蛋白，其功能失调会导致肌肉萎缩等疾病。作者们将Stitch RNA Dysferlin注射进入Dysferlin-KO的小鼠之中，可以实现Dysferlin在四头肌等区域显著增加。Dystrophin蛋白在肌营养不良症中心被破坏，但是Dystrophin的大小超过了两个AAV基因组。作者们通过表达Stitch RNA的Dystrophin ΔH2-R15短截型可以实现对肌营养不良的纠正。现有的基因组编辑系统的传递受到AAV递送包装能力的影响。因此，作者们使用Stitch R4.0载体来表达基因编辑器PEmax（StitchR-PE），作者们发现StitchR-PE可以实现82%编辑活性。总的来说，作者们通过开发RNA“裁缝”系统可以实现对mRNA线性连接从而表达融合的蛋白，也可以实现对大蛋白的表达克服腺病毒相关病毒基因治疗包装能力的局限从而纠正肌肉萎缩症等肌肉疾病，最后作者们也证实了Stitch RNA系统可以实现基因编辑活性。原文链接：doi.org/10.1126/science.adp8179制版人：十一
1. A. R. Ferré-D’Amaré, J. A. Doudna, Nucleic Acids Res. 24,977–978 (1996).
2. M. J. Fedor, Annu. Rev. Biophys. 38, 271–299 (2009).
3. J. L. Litke, S. R. Jaffrey, Methods 196, 104–112 (2021).
4. J. L. Litke, S. R. Jaffrey, Nat. Biotechnol. 37, 667–675 (2019). J. L. Litke, S. R. Jaffrey, Nat. Biotechnol. 37, 667–675 (2019).
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