背景高？杂带多？实验结果又不好？问师兄、查资料，经历一番起早贪黑，摸爬滚打后，得到了好的结果又怎样？了解“台前”，不懂“幕后”，就称不上一枚合格的资深“科研狗”！
抗体作为蛋白研究的常用试剂，都不陌生，但是如果了解抗体制备幕后的故事，不仅能让你选择抗体时事半功倍，更重要的——在学弟学妹面前瞬间又高了一个逼格。
有“求甚解”的渴求，才是资深“科研狗”的必备素养！
有关单抗制备的方法，今天这里主要介绍常用的杂交瘤细胞法。
高中生物老师就告诉我们，杂交瘤细胞是由B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合形成，然后呢？然后就是没有然后......现在近而立之年的我们，依然还是只知道这句类似“皮囊”的话，融合以后就坐等抗体大丰收么？NO！还需要经过HAT培养基的筛选和克隆化等一系列过程，才能得到能分泌特异性抗体的单克隆细胞株，这种特异性抗体，就是我们常说的单抗。
单抗广泛用于多种领域，如，科研、诊断和免疫治疗等，并且拥有超越多抗的诸多优点，如，生物活性单一、抗原结合特异性强、易根据需要进行修饰和定制等。
图1.B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的区别与联系
杂交瘤单克隆抗体制备流程小结：
利用杂交瘤技术制备单抗的一般流程为：抗原制备、动物免疫（产生致敏B淋巴细胞）、细胞融合（聚乙二醇，PEG）、杂交瘤细胞的选择性培养（HAT培养基）、杂交瘤细胞的筛选及克隆化（有限稀释法、软琼脂法、单细胞显微操作法）、单克隆抗体的鉴定（ELISA、RIA、免疫荧光检测）、杂交瘤细胞的冻存、单克隆抗体的大量生产（体内诱导及体外培养法）、纯化（蛋白A/G、辛酸-硫酸铵沉淀）。
图2.杂交瘤单克隆抗体制备流程
杂交瘤单克隆抗体制备常见问题知多少？
1.HAT培养基筛选杂交瘤细胞的原理
通常细胞中核酸合成有两条途径：主要途径和补偿途径。叶酸作为主要途径的重要辅酶参与DNA分子的合成，而氨基碟呤是一种叶酸拮抗物，当其存在时，可以阻断该途径；补偿途径可以利用次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。
我们知道HAT选择性培养基是在动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸苷（T），而常用的骨髓瘤细胞是HGPRT缺陷型，其不能利用补偿途径合成DNA。只有骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合形成的杂交瘤细胞，既具有淋巴B细胞的补偿途径，又具有骨髓瘤细胞的无限增殖特性，因此能在HAT培养基中存活并增殖。
2.二次筛选有何意义
在单抗制备过程中，由于B淋巴细胞的特异性不同，经HAT培养基筛选的杂交瘤细胞的特异性亦存在差异，只有少数是分泌预定特异性单抗的细胞，因此，需进行二次筛选。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。经全面鉴定其所分泌单抗的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力和识别的抗原表位等后，进行冻存。
3.融合前，为何要进行骨髓瘤细胞的筛选
融合前，应用含8-AG（即8-氮鸟嘌呤）的培养基对骨髓瘤细胞进行筛选，防止细胞发生突变恢复HGPRT活性。HGPRT是补偿途径嘌呤的主要合成酶，8-AG可以作为合成DNA的原料，但由于它是一种碱性细胞杀伤因子，对细胞有毒，其存在会使细胞死亡。而HGPRT缺陷的骨髓瘤细胞不能通过补偿途径合成DNA，故可以存活，因而经8-AG筛选后的细胞都是HGPRT酶缺陷株。
4.克隆化时间选择
克隆化是为了获得产生预定抗体的单一细胞系，常用有限稀释法。克隆化应尽早进行并反复筛选，但也不宜过早，太早杂交瘤细胞性状不稳定，数量少且有丢失染色体的倾向；太晚各种细胞同时旺盛生长，互相争夺营养及空间，目的细胞可能被其他细胞淹没并淘汰。克隆化的阳性杂交瘤细胞，经过一段时间培养后，可能会因细胞突变或染色体丢失，使部分细胞失去产生抗体的能力，所以需要进行多次克隆化。
5.细胞融合注意事项
污染是融合实验最大的失败原因，干净的环境及适宜的无菌操作技术是融合成功的关键；技术上的误差也常常会导致融合失败。如，供者淋巴细胞无免疫应答等。
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