吉林大学张海红团队 | 一款circRNA-DC癌症疫苗的设计和临床前评估

导读：与传统的癌症疫苗相比，DC 疫苗具有直接激活 T 细胞的能力，显著增强抗原特异性 T 细胞反应。在 DC 疫苗中负载肿瘤抗原的方法有很多，其中环状RNA（circRNA）稳定性高、免疫原性和细胞毒性低，是一种具有广泛优势的可选策略。

FAPα和 survivin 被认为是两种有应用前景的肿瘤相关抗原（TAA）。2024年8月20日，吉林大学生命科学学院艾滋病疫苗国家工程实验室张海红教授开发了一种名为 sPD1/FS 的DNA疫苗，它结合了人类 sPD1、FAPα 和 survivin 。该疫苗旨在通过sPD1靶向DC，并刺激针对癌症相关成纤维细胞（CAF）和肿瘤细胞的抗原特异性 T 细胞的产生。

近日，张海红教授继续在Research Square（预印本网站）发表文章：CircRNA-loaded DC vaccine in combination with low-dose gemcitabine induced potent anti-tumor immunity in pancreatic cancer model。他们在 DC 疫苗中负载编码肿瘤抗原（FAPα和survivin ）的环状 RNA（circRNA），以诱导更强的 CD8+ T 细胞反应。而且，他们进一步将 DC 疫苗与吉西他滨 （Gem）联合，这种联合治疗显著延长了腺癌小鼠的存活率，凸显了其作为稳健抗癌治疗策略的潜力。

应用技术：mRNA序列设计、载体构建、体外转录（IVT）、RNA环化、circRNA纯化、RNase R消化、DC细胞分离与培养、细胞转染（体外研究）、流式细胞、小鼠试验（体内研究）

树突状细胞（DC）被认为是最有效的抗原呈递细胞，在先天免疫和适应性免疫中起着关键作用。它们摄取并呈递抗原，激活幼稚T细胞，诱导强烈的抗原特异性 T 细胞反应，并产生免疫记忆。DC介导的抗原呈递在免疫调节中起重要作用。抗原加工和呈递失调是肿瘤逃避免疫系统检测的重要机制。DC 和某些参与抗原呈递的分子，如TAP 和HLA-I，在胰腺癌中显著降低。由于这些特性，DC已成为一种很有前途的癌症治疗工具。与传统的癌症疫苗相比，DC疫苗具有直接激活T细胞的能力，因为抗原是内源性的。这种机制导致抗原特异性T细胞反应的显著增强。

尽管与其他免疫疗法相比，DC疫苗可以更直接地诱导抗原特异性T细胞反应，但疗效仍然有限。这主要是由于免疫抑制性肿瘤微环境（TME）和肿瘤抗原调节。通过将DC疫苗与其他疗法联合使用来克服 DC 疫苗的局限性有望进一步增强抗肿瘤效果。

吉西他滨（Gem）被公认为晚期胰腺癌患者的标准治疗药物，单一给药时不足以完全阻止肿瘤进展。先前的研究表明，胰腺癌患者瘤内CD8+ T 细胞的增加与存活率延长之间存在很强的相关性。肿瘤细胞采用各种逃逸机制，使它们对细胞毒性 T 淋巴细胞（CTL）反应不敏感，而 Gem 已被证明可以增强肿瘤细胞对 CTL 介导的反应的易感性。此外，先前的研究表明，Gem 选择性地减少了 TME 内免疫抑制细胞的数量，包括髓源性抑制细胞（MDSC）和调节性T细胞（Treg）。同时，它似乎促进了局部DC细胞从凋亡肿瘤细胞中摄取抗原。因此，Gem DC疫苗的组合可能会产生协同治疗效果。

采用PIE策略合成circRNA，表达FAPα 和 survivin融合抗原，命名为circRNA^FS。从 C57BL/6 小鼠股骨和胫骨中分离出骨髓细胞，在体外刺激和培养它们，并成功获得 DC。

将circRNA^FS转染到DC 中，WB确认其表达，转染效率约为 74.44% 。

通过后肢肌内注射PD1/FS 疫苗，通过尾静脉注射circRNA^FS-DC疫苗。与 sPD1/FS 组相比，circRNA^FS-DC 组的 CD8+ T 细胞数量显著增加，而 CD4+ T 细胞没有表现出任何显著变化。有意思的是，无论是否负载circRNA，DC 组和circRNA^FS-DC 组免疫小鼠脾脏细胞均显示出强烈的抗原特异性的T细胞免疫反应。与circRNA^FS-DC 组相比，sPD1/FS 组的存活素和 FAPα 抗体水平更高。上述结果表明，与 sPD1/FS 组相比，，circRNA^FS-DC 疫苗诱导的免疫反应更偏向 Th1 型。

在已建立的小鼠 Panc02 模型中评估circRNA^FS-DC疫苗的抗肿瘤作用。相比DC疫苗或者 sPD1/FS 组，circRNA^FS-DC疫苗组表现出更显著的治疗效果，肿瘤抑制率达到 69%。在脾脏中，circRNA^FS-DC 组中 CD8+ T 细胞和 CD4+ T 细胞的数量增加，同时抗原特异性 T 细胞反应增强。在肿瘤组织内，circRNA^FS-DC 组中 CD45 + 免疫细胞、CD8 + T 细胞、CD4 + T 细胞和 NK 细胞的数量显著增加，MDSCs 显著降低， Tregs 显著增加。此外，还检测到circRNA^FS-DC 组中瘤内Th1 型细胞因子（IFN-γ和IL2）略微有所增加。总而言之，circRNA^FS-DC疫苗对 Panc02 胰腺癌有更好的治疗效果，但它导致 Tregs 增加。

低剂量 Gem 可以选择性地消耗 Tregs。因此，Gem 和 DCFS 疫苗的组合可能会减轻 Tregs 的免疫抑制作用，从而提高治疗效果。

在已建立的 Panc02 小鼠模型中评估了联合治疗 （circRNA^FS-DC疫苗+ Gem） 的治疗效果。结果显示，与circRNA^FS-DC疫苗或者Gem单独治疗组相比，联合治疗进一步抑制了肿瘤生长，达到了 89% 的肿瘤抑制率。当单独使用 Gem 进行治疗时，观察到小鼠体重显著下降，而联合治疗则未观察到这种现象。联合治疗的小鼠生存期显著延长，44% 的小鼠在第 60 天仍存活。

在脾脏中，观察到联合治疗组 CD8 + T 细胞的数量显著增加。在肿瘤中，使用 Gem 导致联合治疗组浸润 Tregs 的显著减少。CD45+ 免疫细胞、CD8+ T 细胞和 CD4+ T 细胞也显著减少，但仍显著高于其他组。联合治疗组的 NK 细胞和活化的 DC 显著增加，而 MDSCs 无显著变化。

免疫记忆对于肿瘤治疗的长期有效性至关重要。在circRNA^FS-DC疫苗治疗完成后 30 天，联合治疗组表现出明显更强的免疫记忆。与其他组相比，抗原蛋白再刺激后，脾脏CD8+ T 细胞的数量更高。

低剂量 Gem 还可以通过诱导免疫原性细胞死亡 （ICD） 来消除肿瘤细胞。Gem 组和联合治疗组诱导了 ICD。研究者测试了两种抗原（MET与EFNB2），它们在小鼠的 Panc02 胰腺癌肿瘤中高表达，但在正常胰腺组织中低表达，与疫苗无关。结果发现，联合治疗组诱导了对这两种抗原的显著抗原特异性 T 细胞反应。这表明 Gem 导致抗原通过 ICD 传播，并与circRNA^FS-DC疫苗协同作用。

对从联合治疗组和空白对照组获得的肿瘤组织进行RNA-seq转录组学分析。结果发现，大量基因 （联合治疗组 768 个，空白对照组 434 个） 在两组中表现出差异表达。与淋巴细胞浸润相关的基因 Ccl17 、 Ccl22 和 Pla2g2d 在联合治疗后显著增加。与 T 细胞活化和细胞毒功能相关的基因，包括 CD28、Tnfrsf4 和 Cd40lg，显著上调。与对照组相比，联合治疗显著增加了 CD8+ T 细胞的浸润，也增强了 T 细胞产生 IFN-γ 的能力。相比之下，联合治疗抑制了肿瘤侵袭相关基因 Trp1 和 Trp2 的表达。与淋巴细胞迁移以及 T 细胞活化和细胞毒性相关的生物过程上调。KEGG 分析也产生了类似的结果，表明联合治疗显著上调了细胞因子-细胞因子受体相互作用和趋化因子信号通路。采用 qRT-PCR 验证转录组结果，获得的趋势基本一致。

这些结果表明，联合治疗促进了 CD8+ T 细胞浸润到肿瘤中，刺激其增殖和活化，并诱导细胞因子的产生以消除肿瘤细胞。

总结来说，这项工作采用环化RNA技术在DC细胞负载抗原，构建了circRNA^FS-DC疫苗，并在 Panc02 胰腺肿瘤模型中证明其具有更好的治疗效果。更进一步地，研究者将circRNA^FS-DC疫苗与Gem 联合使用消除免疫抑制性 Tregs，诱导 ICD 以促进抗原扩散，使得抗肿瘤效果得到进一步提高，为胰腺癌的临床治疗提供了一种非常有前景的RNA疗法。

[1] CircRNA-loaded DC vaccine in combination with low-dose gemcitabine induced potent anti-tumor immunity in pancreatic cancer model.

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