导 读： 埃博拉病毒（ Orthoebolavirus ）是一种危险的病原体，已造成 30 多起疫情爆发。然而，目前获批的疗法范围有限，且它们仅对埃博拉病毒有效，对其他正变形病毒缺乏交叉保护。

2024年 11 月 25 号，中国人民解放军军事医学科学院 陈薇和于长明团队共同在 Emerging Microbes & Infections （影响因子： 8.4 ）发表文章： A pan-orthoebolavirus neutralizing antibody encoded by mRNA effectively prevents virus infection 。他们发现先前分离的人类来源抗体 2G1 可以识别埃博拉病毒每个亚种的糖蛋白（ GP ）， 2G1 可识别丝状病毒中高度保守的表位，并通过阻断 GP 蛋白水解实现中和。此外，研究人员利用 mRNA 技术制备了编码 2G1 抗体的 mRNA-2G1-LNP 制剂，发现其在细胞水平上表现出交叉中和能力，是蛋白形式 IgG 的十倍以上，并且它以低剂量阻断了 EBOV 和 SUDV 假病毒对小鼠的侵袭，无明显的肝毒性。这项研究表明， mRNA-2G1-LNP 制剂是抵抗埃博拉病毒的非常有潜力的候选干预措施。

应用技术 : mRNA 序列设计、 mRNA 序列优化、 UTR 筛选、 poly(A) 筛选、密码子优化、体外转录、 mRNA 磁珠纯化、 mRNA-LNP 包封、细胞转染、流式细胞术、表面等离子共振、 ELISA 、假病毒中和试验、冷冻电镜、受体结合抑制试验等。

埃博拉病毒属于丝状病毒科，病毒呈长丝状体，直径大约为 80-100 纳米。埃博拉病毒粒子由包膜、基质和核衣壳组成，脂质双层结构的病毒包膜表面有许多由 GP 糖蛋白形成的 7-10 纳米长的三聚体刺突。埃博拉病毒属主要分为 6 个种，包括 EBOV ， SUDV ， RESTV ， BDBV ， TAFV 和 BOMV 。其中四种病毒（ EBOV 、 SUDV 、 BDBV 和TAFV ）对人类致病，在过去四十年中引发了 40 多次疫情，病死率高达 25%-90% 。

膜蛋白 GP 是一种 I 型跨膜蛋白，全长 676 个氨基酸 (amino acid, AA) ，形成了病毒颗粒表面的刺突结构。在翻译过程中，它首先形成一个前体 GP 蛋白 (preGP) ，之后在第 501aa 位点被弗林蛋白酶或类弗林内切蛋白酶切割成一个由二硫键连接的 GP1-GP2 片段。三个 GP1-GP2 片段聚集形成的三聚体复合物是埃博拉病毒与宿主细胞受体结合与融合的位点，也是中和性抗体研究的主要靶点。 GP 蛋白的粘蛋白类似区 (Mucin-like domain) 处于 GP1 外侧，结构类似一个帽子。

埃博拉病毒不同亚种 GP 氨基酸序列差异高达 59% ，这对广谱药物的开发构成了极大挑战。最近的一项研究表明，对 EBOV 的既往免疫力对 SUDV 的保护作用有限。两种获批的抗体药物仅靶向 EBOV ，不能交叉中和其他亚种。博拉病毒的多变种和逃逸变异 、在未来疫情中变异的不确定性、疫苗不适用于特定人群以及抗体药物的长开发周期都说明探索广泛或快速起效对策的重要性。广谱型抗体是应对埃博拉病毒的有效手段，通常靶向未遮挡、高度保守的GP2 亚基和 GP1 亚基的碱基区域，通过阻断受体结合后发生的 GP 切割和构象重排来实现中和效应。

研究人员采用流式细胞仪分析 2G1 抗体结合广度，发现 2G1 可以同展示在 239T 细胞表面的六种埃博拉病毒亚种（ EBOV ， SUDV ， RESTV ， BDBV ， TAFV 和 BOMV ）的 GP 糖蛋白结合。他们还表征了 2G1 抗体在粘蛋白结构域存在 （ GP Δ TM ） 或不存在（ GP Δ Muc ） 的情况下对EBOV GP 的重组细胞外形式的亲和力，发现 GP Δ TM 和 GP Δ Muc 的可比动力学常数分别为 5.25 nM 和 5.44 nM 。

埃博拉病毒的进入是由 GP 糖蛋白介导的， GP 将病毒颗粒附着在细胞表面，将其递送到内体，并催化病毒膜和内体膜之间的融合，因此，抗体中和效应主要发生在晚期胞内体中的酸性环境。研究人员观察 PH 改变对 2G1 与GP Δ TM 、 GPΔ Muc 和裂解 GP （ GPcl ） 结合活性的影响。结果发现低pH 值对 2G1 与 GP Δ TM 和 GP Δ Muc 的结合影响最小，同时，还发现 2G1 对 GPcl 结合力非常弱。

接下来，研究人员使用携带 GP 糖蛋白的重组 HIV 假病毒来检测 2G1 抗体的广谱性，结果发现， 2G1 对所有测试的埃博拉病毒亚种均表现出有效的广泛中和作用，半数最大抑制浓度 （ IC50 ） 值范围为0.02 至 0.44 μ g/mL ，优于对照抗体 mAb114 和 FVM04 。

为了剖析重链和轻链对结合的贡献，研究人员准备了 2G1 的野生型和推断种系交叉配对形式（ IGL ）。分析轻链（ VL ）和重链（ VH ）的可变区，比较显示 VL-IGL 和 VL-WT 之间的氨基酸分歧（ 9/106 ）比 VH-IGL 和 VH-WT 之间的氨基酸差异更大（ 6/124 ）。与 2G1-WT 相比， 2G1-HIGL/KWT 和 2G1-IGL 与 GP 的结合活性显著降低（分别降低 91.4 倍和 55.4 倍）。相比之下， 2G1-HWT/KIGL 的结合能力仅比 2G1-WT 低 4.4 倍，强调了重链在结合中的关键作用。通过重链互补决定区（ CDR ）的丙氨酸扫描诱变进一步分析，在 CDR2 中发现了一个关键残基 Y56 ，在 CDR3 中发现了三个关键残基 C99 、 G100B 和 C100D ，这些位置的突变导致 2G1 的结合能力大幅降低， EC50 值比野生型高 59.9 至 133.9 倍。

GP 三聚体（由 GP1-GP2 异二聚体组成）上的表位，包括聚糖帽 （ GC ）、头部、 Mucin 、GP1 核心、 GP1/2 、碱基、 IFL 和HR2 。在这些表位中，远离病毒膜的 GC 、 Head 和 Mucin 在空间上更容易接近，已被证明在疫苗接种过程中具有更高的免疫优势。然而，这些区域是种间序列分歧和自然进化突变的热点。靶向 IFL 、 GP1 核心和头部的抗体表现出高交叉反应频率，其中 IFL 与埃博拉病毒广谱型活性的相关性最强。 ADI-15878 等中和抗体的表位（完全或部分）位于 IFL 结构域中，已知它们可以中和至少四种直肠病毒。值得注意的是，来自疫苗接种者的 2G1 以及来自幸存者的 ADI-15878 识别出位于 GP2 N 端下方的疏水口袋，表明该区域作为广谱性埃博拉病毒药物或疫苗开发靶点的重要性。

为阐明 2G1 结合和中和机制的结构基础，研究者使用冷冻电子显微镜以 2.98 Å 的分辨率确定了 2G1-Fab 与 EBOV GP Δ Muc 复合物的结构。 2G1 轻链和重链 的中央连接几乎与 GP1 亚基的主体平行排列，三个 Fab 与每个 GP 三聚体接合。尽管 2G1 与 ADI-15878 具有相同的结合模式，但两种抗体之间存在明显的区别。 2G1 识别由 IFLtip 、 HR1 、 GP1 核心和 GP2 N 端组成的四级表位，该表位结合了针对埃博拉病毒病最有前途的广谱混合物成分的表位： ADI-15878 （ IFL + HR1 ）和 ADI-23774 （ 310 口袋 + IFL 碱基 + GP2 N 端）。除了表位的差异外， ADI-15878 还表现出与GPcl 的强结合，并且据推测会阻碍受体结合后的融合触发过程。相反， 2G1 与GPcl 的结合较弱，并通过阻断 GP 的上游切割来中和病毒。

研究人员采用 mRNA 技术来表达 2G1 抗体的重链和轻链，初始 mRNA 序列包含 Cap1 结构、 5' UTR （ TEV ）、 2G1 重链或轻链的编码序列、 3' UTR （ F-I ）、 100 个核苷酸的 poly(A) 尾和元件之间的 Linker 。将 mRNA 转染 HEK293 T 细胞，并在多个时间点收获培养上清液。结果发现，转染后 48 小时， 2G1 抗体浓度达到最高限值为 74.4 ng/mL 。

研究者优化 了 mRNA 的组成元件以提高 2G1 抗体翻译效率：

Cap1 和 Cap 0 两种不同类型的帽结构对抗体表达的影响没有统计学上的显著差异。

为了简化组件替换和优化，研究人员在初始 mRNA 序列设计时在不同的元件之间引入了 Linker ，然而，这些 Linker 可能会干扰 mRNA 二级结构。去除 Linker 后，抗体表达显著增加。

在 HBA1 、 HBB 及 4 种候选 UTR 组合序列中，天然 HBA1 和 HBB UTR 表现出最高的翻译效率。将 HBA1 和 HBB 的 UTR 序列交换组合，并且引入非洲爪蟾 β 珠蛋白（ XBB ）的 5 ’ UTR 序列，结果发现，利用 HBA1-5' UTR 的 mRNA （ HBA1-HBB 和 HBA1 ）显示出最佳的翻译效果，表达的抗体浓度超过 1500 ng/mL 。

用三磷酸尿苷 （ UTP ）代替 N1- 甲基假尿苷酸（ψ）在细胞水平上对 mRNA 翻译的效率没有显著影响。

两种不同形式的 poly (A) 尾，即 A30-linker-A70 和 A70C30 的 mRNA-2G1 抗体表达水平没有显著差异。

编码序列的优化在数值上增强了抗体生产，尽管与未优化的队列没有显著差异。

使用两种针对亨尼帕病毒的抗体 1E5 和 1B6 验证优化后的 mRNA 元件的翻译效率，发现该 mRNA 骨架序列具有普适性，两种抗体表达水平可分别达到 1835 和 5533 ng/mL 。

将 mRNA 抗体的重链和轻链以五种不同的比例混合到细胞中，确定了其最佳摩尔比为 1 ： 1.1 。配制 LNP 包封的 mRNA-2G1 （ mRNA-2G1-LNP ）。 mRNA-2G1-LNP 的包封效率约为 89.7% ，平均粒径约为 84.6 nm ，在电子显微镜下呈现球形形态。在 293 T 细胞中， mRNA-2G1-LNP 的抗体表达水平要比用 lipofectamine 转染的高 36.6% 。在细胞上清液中， mRNA-2G1-LNP 表达完整 IgG 和少量游离的轻链。为确定 LNP 制剂的稳定性，将 mRNA-2G1-LNP 在 4℃ 下储存 8 周，监测包封效率、有效浓度和细胞水平表达的变化。第 36 天，包封率和有效浓度均未发生显着变化。储存终点 mRNA-2G1-LNP 的细胞水平表达水平是保持在第二周时观察到的 52.4% 。

研究人员评估 mRNA-2G1-LNP 在体外对 rHIV-EBOV 的中和效果。在细胞感染前 6 小时，添加浓度为 0.1 μg/mL 的 mRNA-2G1-LNP ，能够中和 90% 的假病毒。 mRNA-2G1-LNP 抗体对 rHIV-EBOV 的 IC50 值为 16.4 ng/mL ，中和能力是 IgG 的 19.8 倍。在基于生物发光成像的 BALB/c 小鼠感染模型中评估 mRNA-2G1-LNP 的体内保护活性。小鼠在攻击前 12 小时通过尾静脉注射不同剂量的 mRNA-2G1-LNP ，所有注射组均表现出良好的保护效果。最低剂量组 0.125 mg/kg 小鼠体内的总发光值仅为 PBS 组的 11.9% ，高剂量组小鼠未未检测到发光信号。

同样， mRNA-2G1-LNP 体外可有效中和 rHIV-SUDV ， IC50 为 32.6 ng/mL ，是 IgG 中和活性的 12.5 倍。在 SUDV 假病毒的小鼠攻击模型中，预防性注射 mRNA-2G1-LNP 可提供足够的保护， 0.125 mg/kg 的最小剂量组小鼠体内总发光强度仅为对照组的 6.72% ，而高剂量组则完全阻断了小鼠感染 rHIV-SUDV 。

通过尾静脉注射给予 mRNA-2G1-LNP 、 2G1 抗体或空壳 LNP ，研究小鼠 mRNA-2G1-LNP 的表达动力学和代谢特征。注射 mRNA-2G1-LNP 后，血清抗体浓度迅速升高。 6h 时， 1 和 0.5 mg/kg mRNA-2G1-LNP 剂量组的平均血清抗体水平分别为 25.80 和 8.45 μ g/mL 。 24 小时，血清抗体达到峰值：分别为 31.73 和 11.36 μ g/mL 。第 7 天，血清抗体浓度分别降至 14.19 和 6.67 μ g/mL 。值得注意的是，这些血清抗体浓度高于 2G1 在体外对真实 EBOV 的 IC90 值（ 3.2 μ g/mL ）。在小鼠中观察到的人类 2G1 半衰期较短，估计约为三天，这可能限制了 mRNA 编码的抗体水平进一步增强和延长的可能性。

为评估 mRNA-2G1-LNP 在小鼠体内的肝毒性，研究者监测了给药后小鼠体重和肝功能的血清生化标准，包括丙氨酸转氨酶（ ALT ）、天冬氨酸转氨酶（ AST ）、乳酸脱氢酶（ LDH ）和肌酐（ CR ）。所有注射组中小鼠的体重都表现出最初的下降，然后恢复，然后在第 14 天达到同等体重。 mRNA-2G1-LNP 和 IgG 组之间的体重没有显着差异 。体重增加的早期波动可能与该阶段的密集采血工作有关。1mg/kg mRNA-2G1-LNP 的剂量对小鼠的肝功能没有显着影响，与 PBS 组相比，四种肝功能的生化标准没有统计学差异。

据称， 2G1 抗体是第一个已报道的能够与所有六种埃博拉病毒亚种的天然 G 结构结合的抗体。本研究证实了 2G1 抗体是一种广谱型的埃博拉病毒中和抗体，并阐明了其中和活性的结构基础和中和机制，从而为开发针对埃博拉病毒的广谱型药物提供了候选成分和设计原理。通过优化表达 2G1 抗体的 mRNA 元件，找到了一种普适性的、表达中和抗体的 mRNA 元件组合，为其他基于 mRNA-LNP 的治疗方法提供了重要的参考信息。

基于在 mRNA 序列设计和纯化方面的卓越经验，重磅推出 mRNA 定制化合成服务，全流程涵盖质粒模板序列设计、 IVT RNA 制备、 RNA 纯化、 RNA-LNP 包封、 mRNA 和 LNP 质量检测。详细请联系菌菌： 15342234370 。

[1] Fan P, Sun B, Liu Z, Fang T, Ren Y, Zhao X, Song Z, Yang Y, Li J, Yu C, Chen W. A pan-orthoebolavirus neutralizing antibody encoded by mRNA effectively prevents virus infection. Emerg Microbes Infect. 2024 Dec;13(1):2432366. doi: 10.1080/22221751.

版

权

声

明

本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系([email protected])，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。