导读：埃博拉病毒（Orthoebolavirus）是一种危险的病原体，已造成30多起疫情爆发。然而，目前获批的疗法范围有限，且它们仅对埃博拉病毒有效，对其他正变形病毒缺乏交叉保护。

2024年11月25号，中国人民解放军军事医学科学院陈薇和于长明团队共同在Emerging Microbes & Infections（影响因子：8.4）发表文章：A pan-orthoebolavirus neutralizing antibody encoded by mRNA effectively prevents virus infection。他们发现先前分离的人类来源抗体 2G1 可以识别埃博拉病毒每个亚种的糖蛋白（GP），2G1可识别丝状病毒中高度保守的表位，并通过阻断 GP 蛋白水解实现中和。此外，研究人员利用mRNA技术制备了编码2G1抗体的mRNA-2G1-LNP制剂，发现其在细胞水平上表现出交叉中和能力，是蛋白形式IgG的十倍以上，并且它以低剂量阻断了 EBOV 和 SUDV 假病毒对小鼠的侵袭，无明显的肝毒性。这项研究表明，mRNA-2G1-LNP 制剂是抵抗埃博拉病毒的非常有潜力的候选干预措施。

应用技术: mRNA序列设计、mRNA序列优化、UTR筛选、poly(A)筛选、密码子优化、体外转录、mRNA磁珠纯化、mRNA-LNP包封、细胞转染、流式细胞术、表面等离子共振、ELISA、假病毒中和试验、冷冻电镜、受体结合抑制试验等。

埃博拉病毒属于丝状病毒科，病毒呈长丝状体，直径大约为80-100纳米。埃博拉病毒粒子由包膜、基质和核衣壳组成，脂质双层结构的病毒包膜表面有许多由GP糖蛋白形成的7-10纳米长的三聚体刺突。埃博拉病毒属主要分为6个种，包括EBOV，SUDV，RESTV，BDBV，TAFV和BOMV。其中四种病毒（EBOV、SUDV、BDBV和TAFV）对人类致病，在过去四十年中引发了40多次疫情，病死率高达25%-90%。

膜蛋白GP是一种I型跨膜蛋白，全长676个氨基酸(amino acid, AA)，形成了病毒颗粒表面的刺突结构。在翻译过程中，它首先形成一个前体GP蛋白(preGP)，之后在第501aa位点被弗林蛋白酶或类弗林内切蛋白酶切割成一个由二硫键连接的GP1-GP2片段。三个GP1-GP2片段聚集形成的三聚体复合物是埃博拉病毒与宿主细胞受体结合与融合的位点，也是中和性抗体研究的主要靶点。GP蛋白的粘蛋白类似区(Mucin-like domain)处于GP1外侧，结构类似一个帽子。

埃博拉病毒不同亚种GP氨基酸序列差异高达59% ，这对广谱药物的开发构成了极大挑战。最近的一项研究表明，对EBOV的既往免疫力对SUDV的保护作用有限。两种获批的抗体药物仅靶向EBOV，不能交叉中和其他亚种。博拉病毒的多变种和逃逸变异、在未来疫情中变异的不确定性、疫苗不适用于特定人群以及抗体药物的长开发周期都说明探索广泛或快速起效对策的重要性。广谱型抗体是应对埃博拉病毒的有效手段，通常靶向未遮挡、高度保守的GP2亚基和GP1亚基的碱基区域，通过阻断受体结合后发生的GP切割和构象重排来实现中和效应。

研究人员采用流式细胞仪分析2G1抗体结合广度，发现2G1可以同展示在239T细胞表面的六种埃博拉病毒亚种（EBOV，SUDV，RESTV，BDBV，TAFV和BOMV）的GP糖蛋白结合。他们还表征了2G1抗体在粘蛋白结构域存在（GPΔTM）或不存在（GPΔMuc）的情况下对EBOV GP的重组细胞外形式的亲和力，发现 GPΔTM和GPΔMuc的可比动力学常数分别为5.25nM和5.44nM。

埃博拉病毒的进入是由GP糖蛋白介导的，GP将病毒颗粒附着在细胞表面，将其递送到内体，并催化病毒膜和内体膜之间的融合，因此，抗体中和效应主要发生在晚期胞内体中的酸性环境。研究人员观察PH改变对2G1与GPΔTM、 GPΔMuc和裂解GP（GPcl）结合活性的影响。结果发现低pH值对2G1与GPΔTM和GPΔMuc的结合影响最小，同时，还发现2G1对GPcl结合力非常弱。

接下来，研究人员使用携带GP糖蛋白的重组HIV假病毒来检测2G1抗体的广谱性，结果发现，2G1对所有测试的埃博拉病毒亚种均表现出有效的广泛中和作用，半数最大抑制浓度（IC50）值范围为0.02至0.44μg/mL，优于对照抗体mAb114和FVM04。

为了剖析重链和轻链对结合的贡献，研究人员准备了2G1的野生型和推断种系交叉配对形式（IGL）。分析轻链（VL）和重链（VH）的可变区，比较显示 VL-IGL和VL-WT之间的氨基酸分歧（9/106）比VH-IGL和VH-WT之间的氨基酸差异更大（6/124）。与2G1-WT相比，2G1-HIGL/KWT和2G1-IGL与GP的结合活性显著降低（分别降低91.4倍和55.4倍）。相比之下，2G1-HWT/KIGL的结合能力仅比 2G1-WT 低 4.4 倍，强调了重链在结合中的关键作用。通过重链互补决定区（CDR）的丙氨酸扫描诱变进一步分析，在CDR2中发现了一个关键残基Y56，在 CDR3 中发现了三个关键残基C99、G100B和C100D，这些位置的突变导致2G1的结合能力大幅降低，EC50值比野生型高59.9至133.9倍。

GP三聚体（由GP1-GP2异二聚体组成）上的表位，包括聚糖帽（GC）、头部、Mucin、GP1核心、GP1/2、碱基、IFL和HR2。在这些表位中，远离病毒膜的GC、Head和Mucin在空间上更容易接近，已被证明在疫苗接种过程中具有更高的免疫优势。然而，这些区域是种间序列分歧和自然进化突变的热点。靶向IFL、GP1核心和头部的抗体表现出高交叉反应频率，其中IFL与埃博拉病毒广谱型活性的相关性最强。ADI-15878等中和抗体的表位（完全或部分）位于IFL结构域中，已知它们可以中和至少四种直肠病毒。值得注意的是，来自疫苗接种者的2G1以及来自幸存者的 ADI-15878 识别出位于GP2 N端下方的疏水口袋，表明该区域作为广谱性埃博拉病毒药物或疫苗开发靶点的重要性。

为阐明2G1结合和中和机制的结构基础，研究者使用冷冻电子显微镜以2.98 Å的分辨率确定了2G1-Fab与EBOV GPΔMuc复合物的结构。2G1轻链和重链的中央连接几乎与GP1亚基的主体平行排列，三个 Fab 与每个GP三聚体接合。尽管2G1与ADI-15878具有相同的结合模式，但两种抗体之间存在明显的区别。2G1识别由IFLtip、HR1、GP1核心和GP2 N端组成的四级表位，该表位结合了针对埃博拉病毒病最有前途的广谱混合物成分的表位：ADI-15878（IFL+HR1）和ADI-23774（310口袋+IFL碱基+ GP2N端）。除了表位的差异外，ADI-15878还表现出与GPcl的强结合，并且据推测会阻碍受体结合后的融合触发过程。相反，2G1与GPcl的结合较弱，并通过阻断GP的上游切割来中和病毒。

研究人员采用mRNA技术来表达2G1抗体的重链和轻链，初始mRNA序列包含Cap1结构、5'UTR（TEV）、2G1重链或轻链的编码序列、3'UTR（F-I）、100个核苷酸的poly(A)尾和元件之间的Linker。将mRNA转染HEK293T细胞，并在多个时间点收获培养上清液。结果发现，转染后48小时，2G1 抗体浓度达到最高限值为74.4ng/mL。

研究者优化了mRNA的组成元件以提高2G1抗体翻译效率：

Cap1和Cap0两种不同类型的帽结构对抗体表达的影响没有统计学上的显著差异。

为了简化组件替换和优化，研究人员在初始mRNA序列设计时在不同的元件之间引入了Linker，然而，这些Linker可能会干扰mRNA二级结构。去除Linker后，抗体表达显著增加。

在HBA1、HBB及4种候选UTR组合序列中，天然HBA1和HBB UTR表现出最高的翻译效率。将HBA1和HBB的UTR序列交换组合，并且引入非洲爪蟾β珠蛋白（XBB）的5’UTR序列，结果发现，利用 HBA1-5' UTR的mRNA（HBA1-HBB和HBA1）显示出最佳的翻译效果，表达的抗体浓度超过1500 ng/mL。

用三磷酸尿苷（UTP）代替N1-甲基假尿苷酸（ψ）在细胞水平上对mRNA翻译的效率没有显著影响。

两种不同形式的poly(A)尾，即A30-linker-A70和A70C30的mRNA-2G1抗体表达水平没有显著差异。

编码序列的优化在数值上增强了抗体生产，尽管与未优化的队列没有显著差异。

使用两种针对亨尼帕病毒的抗体1E5和1B6验证优化后的mRNA元件的翻译效率，发现该mRNA骨架序列具有普适性，两种抗体表达水平可分别达到1835和5533 ng/mL。

将mRNA抗体的重链和轻链以五种不同的比例混合到细胞中，确定了其最佳摩尔比为1：1.1。配制LNP包封的mRNA-2G1（mRNA-2G1-LNP）。mRNA-2G1-LNP的包封效率约为89.7%，平均粒径约为 84.6 nm，在电子显微镜下呈现球形形态。在293 T细胞中，mRNA-2G1-LNP 的抗体表达水平要比用lipofectamine转染的高36.6%。在细胞上清液中，mRNA-2G1-LNP 表达完整 IgG和少量游离的轻链。为确定LNP制剂的稳定性，将mRNA-2G1-LNP在4℃下储存8周，监测包封效率、有效浓度和细胞水平表达的变化。第36天，包封率和有效浓度均未发生显着变化。储存终点mRNA-2G1-LNP的细胞水平表达水平是保持在第二周时观察到的52.4%。

研究人员评估mRNA-2G1-LNP在体外对rHIV-EBOV 的中和效果。在细胞感染前6小时，添加浓度为0.1 μg/mL的mRNA-2G1-LNP，能够中和90% 的假病毒。mRNA-2G1-LNP抗体对rHIV-EBOV的IC50值为16.4ng/mL，中和能力是 IgG 的19.8倍。在基于生物发光成像的BALB/c小鼠感染模型中评估 mRNA-2G1-LNP的体内保护活性。小鼠在攻击前12小时通过尾静脉注射不同剂量的mRNA-2G1-LNP，所有注射组均表现出良好的保护效果。最低剂量组0.125 mg/kg小鼠体内的总发光值仅为PBS组的11.9%，高剂量组小鼠未未检测到发光信号。

同样，mRNA-2G1-LNP体外可有效中和rHIV-SUDV，IC50 为 32.6 ng/mL，是IgG中和活性的12.5倍。在SUDV假病毒的小鼠攻击模型中，预防性注射mRNA-2G1-LNP可提供足够的保护，0.125mg/kg的最小剂量组小鼠体内总发光强度仅为对照组的6.72%，而高剂量组则完全阻断了小鼠感染rHIV-SUDV 。

通过尾静脉注射给予mRNA-2G1-LNP、 2G1抗体或空壳LNP，研究小鼠mRNA-2G1-LNP的表达动力学和代谢特征。注射mRNA-2G1-LNP 后，血清抗体浓度迅速升高。6h时，1和0.5 mg/kg mRNA-2G1-LNP剂量组的平均血清抗体水平分别为25.80和8.45μg/mL。24小时，血清抗体达到峰值：分别为31.73和11.36μg/mL。第7天，血清抗体浓度分别降至14.19和6.67μg/mL。值得注意的是，这些血清抗体浓度高于2G1在体外对真实EBOV的IC90值（3.2μg/mL）。在小鼠中观察到的人类2G1半衰期较短，估计约为三天，这可能限制了mRNA编码的抗体水平进一步增强和延长的可能性。

为评估mRNA-2G1-LNP在小鼠体内的肝毒性，研究者监测了给药后小鼠体重和肝功能的血清生化标准，包括丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）和肌酐（CR）。所有注射组中小鼠的体重都表现出最初的下降，然后恢复，然后在第14天达到同等体重。mRNA-2G1-LNP和IgG组之间的体重没有显着差异。体重增加的早期波动可能与该阶段的密集采血工作有关。1mg/kg mRNA-2G1-LNP 的剂量对小鼠的肝功能没有显着影响，与PBS组相比，四种肝功能的生化标准没有统计学差异。

据称，2G1抗体是第一个已报道的能够与所有六种埃博拉病毒亚种的天然 G结构结合的抗体。本研究证实了2G1抗体是一种广谱型的埃博拉病毒中和抗体，并阐明了其中和活性的结构基础和中和机制，从而为开发针对埃博拉病毒的广谱型药物提供了候选成分和设计原理。通过优化表达2G1抗体的mRNA元件，找到了一种普适性的、表达中和抗体的mRNA元件组合，为其他基于mRNA-LNP的治疗方法提供了重要的参考信息。

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[1] Fan P, Sun B, Liu Z, Fang T, Ren Y, Zhao X, Song Z, Yang Y, Li J, Yu C, Chen W. A pan-orthoebolavirus neutralizing antibody encoded by mRNA effectively prevents virus infection. Emerg Microbes Infect. 2024 Dec;13(1):2432366. doi: 10.1080/22221751.

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