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钛酸锶基“气动纳米管”按需递送抗菌药物持续增强骨整合

BCML速递 · 公众号 · · 2024-08-09 22:00

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在骨科领域，针对意外伤害、骨肿瘤、关节炎和许多其他骨疾病引起的骨缺损的治疗是重大的临床挑战。利用骨科植入物促进骨缺损修复已成为一种有前景的治疗策略。然而，骨科植入治疗的临床失败率高仍然是一个普遍存在的问题，其中，细菌感染和无菌性松动以及骨整合不良更是骨科植入物面临的严峻挑战。因此，提高骨科植入物的抗感染和骨整合性能势在必行，而植入物的表面改性是应对上述挑战的有效策略。近期，西北工业大学柔性电子研究院李鹏教授团队设计了一种基于钛酸锶（ SrTiO ₃ ）纳米管（ SrNT ）的近红外（ NIR ）触发“气动纳米炮”涂层，通过气泡产生控制抗生素输送和持续释放 Sr ²⁺ ，有效抗菌并促进成骨。 SrNT 被涂敷于钛植入物表面而形成“炮筒”，在贻贝激发的多巴胺共聚作用下， SrNT 可有效加载“炮弹”（抗生素）和“推进剂”（ NH ₄ HCO ₃ ）。包裹于纳米管中的 NH ₄ HCO ₃ 可在近红外辐射下被热分解为气体，从而推动抗生素按需输送。这种涂层在清除浮游和生物膜形式的典型病原菌方面表现出显著的效果。此外，该涂层可持续释放锶离子，显著促进细胞成骨分化。植入体内后，该涂层显示出良好的抗菌效率（ >99% ），同时减轻了术后炎症而显著促进骨整合。这种气动纳米管涂层为实现钛矫形植入物的抗感染和持续增强骨整合提供了一种很有前途的方法（图 1 ）。

首先，研究者采用电化学阳极氧化法制备钛纳米管（ TNT ），然后通过掺杂和沉积获得了 SrNT 、 TNT-PDA/AB/Cip 、 SrNT-PDA/AB/Cip 。通过扫描电子显微镜（ SEM ）观察到 TNT 呈有序排列结构，水热掺杂 Sr 后， SrNT 的壁厚增加，直径减小，但仍保持原有的 TNT 有序结构。抗生素环丙沙星（ Cip ）与 NH ₄ HCO ₃ 和聚多巴胺（ PDA ）共沉积在 TNT 和 SrNT 上，所得 TNT-PDA/AB/Cip 和 SrNT-PDA/AB/Cip 表现出明显的形态变化。 SrNT-PDA/AB/Cip 的直径进一步减小，这样的尺寸有利于细胞粘附，加厚的内壁证实成功形成功能层（图 2a ）。 X 射线衍射（ XRD ）结果显示了不同样品的相成分（图 2b ）。 SrNT 的 XRD 图谱显示出与 SrT iO ₃ 相关的特征峰，证实了 Sr 的成功掺入。此外， NH ₄ HCO ₃ 的峰出现在 SrNT-PDA/AB/Cip 的 XRD 图谱中，表明涂层中存在 NH ₄ HCO ₃ 。通过水接触角测量评估不同样品的亲水性，与 TNT 、 SrNT 相比， SrNT-PDA/AB/Cip 保留了良好的亲水性（图 2c ）。此外，不同材料的光热转换曲线结果（图 2d ）表明， SrNT-PDA/AB/Cip 中的光热转换效率增强，这种增强的性能归因于 PDA 显著的光热转换能力。为了确定近红外光下涂层上产生气体的可行性，研究者将不同的样品浸入近红外辐射下的水中，并通过立体显微镜观察表面气泡的形成情况（图 2e ）。 SrNT-PDA/Cip 与 SrNT-PDA/AB/Cip 实验条件相同，但不含 NH ₄ HCO ₃ ，在 NIR 照射 30 秒后显示出有限数量的气泡， 60 秒后观察到气泡数量增加。这归因于 PDA 的光热转换特性导致表面温度升高，促使水分蒸发。相反， SrNT-PDA/AB/Cip 样品表面产生了更多的气泡，并且随着照射时间的增加，气泡的数量显著增多，证实了在近红外光下，掺入涂层中的 NH ₄ HCO ₃ 被分解为 CO ₂ 和 NH ₃ 气泡。此外， Cip 和 Sr ²⁺ 的释放曲线（图 2f 、 g ）表明了近红外暴露和酸性微环境均对 SrNT-PDA/AB/Cip 中 Cip 和 Sr ²⁺ 的释放具有促进作用。重要的是， Cip 和 Sr ²⁺ 的释放无论存不存在近红外或酸性微环境的条件下都表现出持久性，具有增强骨整合的巨大潜能。

接着，研究者通过观察与大肠杆菌和金黄色葡萄球菌孵育 12 小时后的存活细菌来评价不同样品的体外抗菌效果。结果显示，琼脂平板涂有各组孵育的细菌溶液后， SrNT-PDA/AB/Cip+NIR 组并未发现明显的细菌菌落，表明细菌被完全根除，这归因于近红外触发 Cip 从涂层中爆发释放，从而显著杀伤细菌。细菌活死染色结果显示也进一步证实了 SrNT-PDA/AB/Cip 涂层的显著抗菌性能及近红外光照射对抗菌性能的增强作用（图 3a-c ）。为了验证近红外辐射对 SrNT-PDA/AB/Cip 所赋予的增强抗菌功效，研究者进行了抑菌圈实验。值得注意的是，在没有 NIR 的条件下，在 SrNT-PDA/AB/Cip 附近出现了由 Cip 初始释放引起的可辨别的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑制圈，而暴露于 NIR 辐射后，抑菌圈明显增大，这归因于 NIR 触发的 Cip 快速释放（图 3d ）。

生物膜形成是感染的关键指标。研究者通过与金黄色葡萄球菌生物膜一起孵育来评估不同样品的抗生物膜活性。细菌与 Ti 、 TNT 和 SrNT 样品共孵育后，仍然存在大量细菌群，菌落计数没有显著差异。 SrNT-PDA/AB/Cip 组由于抗生素的初始渗漏释放，对生物膜表现出一定的抗菌作用。值得注意的是，近红外照射 5 分钟后，生物膜活力明显降低，抗菌效率显著，实现了对生物膜的有效抑制（图 4a 、 b ）。生物膜的活死染色结果（图 4c ）显示， Ti 、 TNT 和 SrNT 样品表面上的生物膜几乎没有死亡细菌。与 SrNT-PDA/AB/Cip 一起孵育后，在生物膜中观察到明显的死菌分布。然而，生物膜中仍然分布着大量的活细菌。当 NIR 照射后，观察到生物膜活力显著降低，生物膜几乎完全充满死细菌，这意味着生物膜中的细菌几乎被完全杀死。总之，上述结果证实了 SrNT-PDA/AB/Cip 涂层在 NIR 辐射下消除生物膜的显著能力，进一步证明了其显著的抗感染性能。

随后，研究者通过全面评估小鼠胚胎成骨细胞前体细胞（ MC3T3-E1 ）的行为，包括活性、增殖和在相应样品表面的粘附性，评估了各种样品的生物相容性。用 AlamarBlue 法检测 MC3T3-E1 的活性（图 5a ），结果显示，经过 5 天的培养后，所有组的细胞存活率都有明显的提高，在所有试验组中都表现出良好的生物相容性。然后研究者通过 SEM 和倒置荧光显微镜观察 MC3T3-E1 前成骨细胞在不同标本上的黏附情况，发现 SrNT-PDA/AB/Cip 表面的细胞黏附状态明显好于 TNT-PDA/AB/Cip ，表明 Sr 可有效促进细胞黏附。此外，细胞骨架荧光染色显示了与扫描电子显微镜的相似结果（图 5b 、 c ）。

研究者通过检测细胞外基质（ ECM ）矿化和碱性磷酸酶（ ALP ）在不同样本表面的活性评估了培养 14 天后 MC3T3-E1 的成骨分化情况。结果显示，在所有组中， SrNT-PDA/AB/Cip 组表面观察到最明显的细胞矿化增强，与所有其他组相比，细胞矿化的定量和显色显著增加。此外， SrNT-PDA/AB/Cip 表面的碱性磷酸酶活性明显高于其他组。这一效应归因于表面形态和 Sr ²⁺ 促进细胞分化能力的共同影响。因此， SrNT-PDA/AB/Cip 涂层具有显著增强 MC3T3-E1 细胞 ECM 矿化和增强 ALP 活性的能力（图 6 ）。

为了进一步评估材料在体内的抗感染能力，研究者采用大鼠种植体相关感染模型研究 SrNT-PDA/AB/CiP 的抗菌效果，将不同样品植入感染金黄色葡萄球菌的大鼠股骨骨髓腔内，评价其体内抗菌活性（图 7a ）。由热像图可得，与 Ti 相比， NIR 辐照下， SrNT-PDA/AB/CIP 的升温更明显（图 7b ）。植入感染的股骨骨髓腔后样本上的细菌存活率显示， SrNT-PDA/AB/CIP 在体内表现出良好的抗菌性能， NIR 照射后细菌数量进一步显著减少（图 7c ）。接着，对从大鼠身上取出并在琼脂平板上滚动的种植体进行检查，发现大量细菌附着在 Ti 、 TNT 和 SrNT 表面，表明种植体部位出现严重感染（图 7d ）。相反，由 SrNT-PDA/AB/Cip 制成的琼脂平板上只有少量细菌出现，表明其具有明显的体内抗菌作用。 NIR 照射后，细菌数量进一步减少，这归因于 NIR 引发的 CIP 的释放。类似地，当从大鼠身上取出样品并浸泡在 LB 培养基中时，含有 Ti 、 TNT 和 SrNT 的 LB 培养基由于细菌生长而明显混浊。相比之下，含有 SrNT-PDA/AB/Cip 的 LB 培养基和浸泡过 NIR 照射的 SrNT-PDA/AB/Cip 的 LB 培养基均保持透明，显示出有效的体内抗感染作用。此外，通过革兰氏染色观察种植部位周围细菌的分布也显示相似的结果（图 7e ）。为了评估炎症，研究者使用 H&E 染色和免疫组织化学染色对种植体周围的组织进行表征。结果显示，相比其他组， SrNT-PDA/AB/Cip 组中性粒细胞和促炎细胞因子的分布明显减少。此外，当 NIR 照射后， SrNT-PDA/AB/Cip+NIR 组周围几乎没有观察到中性粒细胞和促炎症细胞因子的分布，证实了涂层在体内的抗炎作用（图 7f-h ）。

最后，研究者在术后第 28 天取材并进行 Micro-CT 扫描、 H&E 组织学染色、 Masson 三色染色、免疫组织化学染色等综合评价 SrNT-PDA/AB/Cip 的体内骨整合性能。 Micro-CT 结果显示， SrNT-PDA/AB/Cip+NIR 组观察到良好的骨整合，这可能是由于有效地抑制了感染，加速了 Sr ²⁺ 的释放，为骨整合创造了更好的条件（图 8a ）。并且定量结果也证实了 SrNT-PDA/AB/CIP 涂层种植体周围有更多的新骨形成，与 Ti 、 TNT 和 SrNT 种植体相比，新骨产量增加，骨小梁分离减少，反映了涂层具有显著的促进骨整合的作用。此外， NIR 对 SrNT-PDA/AB/Cip 涂层的骨整合效应没有负面影响（图 8b-e ）。然后，通过 Masson 三色染色观察标本周围的结缔组织（图 8f ），图像显示， SrNT-PDA/AB/Cip 涂层种植体周围结缔组织最多，表明在所有样品中骨整合最好。此外， NIR 对 SrNT-PDA/AB/Cip+NIR 组的骨整合无明显影响。并且 H&E 染色、免疫组织化学染色这些发现共同为 SrNT-PDA/AB/Cip 涂层在减轻体内炎症方面的有效性提供了充足的证据（图 8g-i ）。总之， SrNT-PDA/AB/Cip 涂层在体内显著的骨整合能力和抑制炎症的能力表明其在改良 Ti 植入物方面具有巨大的潜力。

综上所述，该研究在 Ti 种植体表面制备了一层“气动纳米管”涂层，其可响应 NIR 辐射，按需释放抗生素并持续释放促成骨活性离子，有效抑制种植体相关感染的同时促进骨整合，为解决临床Ti植入物所遇到的难题提供了策略。

该研究是由西北工业大学柔性电子研究院李鹏教授团队完成，并于 2024 年 6 月 6 日在线发表于 ACS Nano 。

文献信息： Wang K, Gao M, Fan J, Huo J, Liu P, Ding R, Li P. SrTiO ₃ Nanotube-Based "Pneumatic Nanocannon" for On-Demand Delivery of Antibacterial and Sustained Osseointegration Enhancement . ACS Nano 2024, 18: 16011-16026.

供稿：江浩

审校：李家颖

编辑：季威