胞葬作用
（Efferocytosis）已成为国自然项目申请中的科研热点，特别是在动脉粥样硬化、
癌症、慢性炎症性疾病、肥胖和代谢综合征等领域，适度的胞葬作用在疾病中通常被认为发挥保护作用，而失衡的胞葬作用可加重炎症反应和组织损伤。
因此本期将围绕胞葬作用，从
基本
概念、检测方法、干预手段、研究思路、基金申请、与疾病的关系
等方面进行全面的总结。
一、什么是胞葬作用？
胞葬作用指的是吞噬细胞（如巨噬细胞、中性粒细胞等）清除凋亡细胞的过程
。该过程可被视为对凋亡细胞的“埋葬”，其主要目的是
维持组织的稳态和防止炎症反应的发生
，因此
适度的胞葬作用在疾病中通常被认为发挥保护作用
。
图1 胞葬作用的四个阶段（
招募、识别、内化、消化
）[1]
1. 招募（Recruitment）：
凋亡细胞通过释放化学趋化因子（如LPC）招募巨噬细胞，通过与巨噬细胞表面的特异性受体（如G2A、S1P-R1~5、CX3CR1、P2Y2）结合，驱动巨噬细胞向凋亡细胞迁移。
2. 识别（Recognition）:
巨噬细胞通过配体-受体(“Eat-me”信号)相互作用直接或间接地识别凋亡细胞，凋亡细胞信号：磷脂酰丝氨酸（PS）、MFG-E8、Gas6、Pros1、整合素αVβ3、CD36、ICAM3等，巨噬细胞表面受体：Tyro3、MERTK、Axl、TAM、TSP-1、BAI1、RAGE等与这些配体结合，激活下游信号通路。
3. 内化（Internalization）：
激活的信号通路引发细胞骨架重构，促进凋亡细胞的内化。具体机制包括Gas6和Pros1与PS结合，然后通过TAM受体激活Elmo1和Dock180，进而通过RAC1介导细胞骨架重组，最终实现凋亡细胞的包裹和内化。
4. 消化（Digestion）：
内化的凋亡细胞形成吞噬体，并被溶酶体酶降解。Rab5和Rab7在吞噬体的成熟过程中起关键作用，形成吞噬溶酶体（phagolysosome）。其中，LC3相关吞噬作用（LAP）通过LC3与吞噬体膜结合，促进吞噬体与溶酶体的融合，提高凋亡细胞的降解效率。
二、如何检测胞葬作用？
1. 单细胞测序数据分析
根据胞葬作用的四个步骤，相关
亚细胞器、生物学过程
和
通路
涉及：
溶酶体、内吞作用、吞噬体和趋化因子信号通路
，这些
通路相关基因分别参与
溶酶体形成和功能维持、细胞外物质摄取、吞噬体成熟与溶酶体融合，以及细胞迁移和待吞噬物质识别等关键过程
。
因此可
通过单细胞测序数据，重点关注巨噬细胞、中性粒细胞等吞噬细胞的胞葬作用活性，即
比较疾病组与对照组的巨噬细胞、中性粒细胞等吞噬细胞的胞葬作用活性是否有差异
，从而选择胞葬作用作为研究主题；进一步的，当发现胞葬作用活性有差异后，可进一步关注胞葬作用中显著差异基因的表达，从而确定调控胞葬作用活性差异的关键基因。
通过分析可确定：
吞噬细胞是否发生胞葬作用的异常，以及哪些基因调控了胞葬作用？
图2 KEGG分析与胞葬过程相关的关键信号通路[2]
2. 通过ELISA、WB或者qPCR检测胞葬作用相关指标
（1）“find me”信号：
（2）“eat me”信号：
（3）“don't eat me”信号：
图3 通过WB检测胞葬过程相关蛋白指标[2]
3. mCherry-eGFP探针检测
epHero探针作为一种双荧光mCherry-eGFP报告基因，在凋亡细胞中表达，以跟踪它们在吞噬体-溶酶体通路中的转运。pH敏感的eGFP信号在酸性环境中会被淬灭,而更耐酸的mCherry信号则保持稳定。可用于量化吞噬细胞对凋亡细胞的摄取变化,并监测被吞噬物的酸化和降解。
图4 mCherry-eGFP探针实时检测细胞胞葬过程[3]
4. Incucyte® 活细胞分析系统
使用Incucyte®活细胞分析系统实时监测胞葬作用。
-
将吞噬细胞接种到96或384孔板中，并用Incucyte® pHrodo®红色细胞标记试剂盒标记凋亡的靶细胞。
-
将标记后的靶细胞添加至孔板中，进行共培养，实时观察吞噬细胞摄取靶细胞的情况。
-
荧光信号增加表明靶细胞已被内化至吞噬体中。
-
Incucyte®的自动图像分析功能能够定量分析吞噬作用随时间的变化。
图5 Incucyte®活细胞分析系统实时监测胞葬作用
5. 基于双重荧光探针的实时监测果蝇模型
-
使用最新开发的细胞凋亡和吞噬作用传感器：针对细胞凋亡设计GFP探针，当细胞凋亡发生凋亡，Caspases 3/7活化，GFP探针发绿色荧光；针对吞噬作用，使用红色荧光传感器pHlorina，随着pH值降低，荧光强度增强；
-
将这两种传感器结合，形成探针“CharON”：在细胞凋亡时，CharON转基因的细胞发出绿色荧光；被吞噬并在溶酶体中酸化后，GFP荧光淬灭，pHlorina红色荧光增强。
-
通过这一设计培育CharON转基因果蝇，可用于实时监测体内的胞葬过程。
图6 pH-CaspGFP的设计[4]
三、如何干预胞葬作用？
1. 抑制剂
-
应用Arg1抑制剂（如NOAH）可以抑制小胶质细胞和巨噬细胞对死亡/濒死神经元的吞噬作用[5]。
-
使用MerTK抑制剂UNC2250可以抑制巨噬细胞的胞葬作用[6]。
-
使用TIM4阻断抗体可以通过直接抑制吞噬受体TIM4的功能，抑制腹腔驻留巨噬细胞识别和吞噬凋亡细胞的能力（仅适用于腹腔驻留巨噬细胞这类表达TIM4受体的巨噬细胞）[7]。
2. 激活剂
四、如何开展胞葬过程相关课题研究？
1. 确认疾病中胞葬作用发生
首先需确认疾病中胞葬作用的发生，可采用
生信分析并结合实验验证
，重点关注
与胞葬作用密切相关的细胞器和信号通路
，特别是溶酶体功能、内吞作用机制、吞噬体成熟过程以及趋化因子信号转导网络。
2. 潜在调控基因的筛选
通过组学数据，筛选出在疾病条件下可能调控胞葬作用的候选基因；通过差异基因表达分析和功能富集分析，确定基因A作为关键调控因子。
3. 基因A对胞葬作用影响的验证
通过基因敲除和过表达系统，在细胞模型中验证基因A对胞葬作用的具体影响；评估指标包括吞噬体形成、溶酶体融合以及降解效率的变化，结合流式细胞术和荧光显微镜技术进行定量分析。
4. 胞葬作用在基因A介导的疾病进展中的关键作用
通过体内和体外实验，确定胞葬作用在基因A参与疾病进展中的重要性。构建基因A敲除或过表达的动物模型，观察疾病表型变化。同时，通过抑制或激活胞葬作用评估其对疾病进展的影响，以明确胞葬作用的中介角色。
5. 基因A调控胞葬作用的分子机制解析
深入解析基因A在胞葬作用中的具体调控机制，重点关注以下过程：
招募：
研究基因A对"eat-me"信号分子的表达及其对吞噬细胞的吸引作用。
识别：
分析基因A对吞噬细胞表面受体表达和信号转导通路的影响。
可采用转录组学、蛋白质组学及蛋白互作组学技术，进一步解析基因A对胞葬过程的作用机制。
五、如果研究胞葬作用，有哪些可参考范文和基金案例？
1.案例文章：
1.1胞葬作用在疾病某个病理过程中的作用和机制；
案例1
CD276-dependent efferocytosis by tumor-associated macrophages promotes immune evasion in bladder cancer. Nat Commun. 2024 Apr 1;15(1):2818.
CD276依赖的肿瘤相关巨噬细胞通过凋亡细胞清除促进膀胱癌免疫逃逸的机制。
CD276在肿瘤相关巨噬细胞中促进凋亡细胞清除：通过激活溶酶体信号通路和转录因子JUN调控AXL和MerTK的表达，从而抑制T细胞浸润并促进肿瘤生长。
案例2
Efferocytosis reprograms the tumor microenvironment to promote pancreatic cancer liver metastasis. Nat Cancer. 2024 May;5(5):774-790.
巨噬细胞通过胞葬作用导致肿瘤微环境重编程，以促进胰腺癌肝转移。
吞噬凋亡细胞的巨噬细胞激活溶酶体酸化和LXRα/RXRα信号通路，上调精氨酸酶1的表达，从而抑制T细胞浸润并促进肿瘤生长。
1.2药物通过胞葬作用改善疾病的作用机理；
案例：
Bioengineered Nanospores Selectively Blocking LC3-Associated Phagocytosis in Tumor-Associated Macrophages Potentiate Antitumor Immunity. ACS Nano. 2023 Jun 13;17(11):10872-10887.
阻断肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）胞葬作用的纳米孢子（PC-CW）增加抗肿瘤免疫。
PC-CW通过阻断TAMs的胞葬作用延迟其吞噬肿瘤碎片的降解，增强抗原呈递并通过STING信号和TAM重新极化，启动抗肿瘤免疫反应的多米诺效应，从而在化疗-光热疗法后显著增强CD8+ T细胞反应，控制肿瘤生长并防止转移。
2.基金案例
案例1：
IL-4协同精氨酸优化种植初期
巨噬细胞胞葬作用
和成骨微环境的作用及机制研究
案例2：
转录因子RBPJ通过H3K9me3/H4AC调控
巨噬细胞胞葬
在动脉粥样硬化斑块稳定性中的作用机制研究
案例3：
TREM2相关胞葬
在AMSC-exo肝衰竭治疗中的作用和机制研究
案例4：
正畸压力下成牙骨质细胞Rab35介导的外泌体释放调控
巨噬细胞极化与胞葬作用
减轻牙根吸收的作用及机制研究
案例5：
金属-柳氮磺吡啶缓释复合物增强
DCs胞葬作用
促进糖尿病足愈合的机制研究
案例6
：
Rab11Fip1调控巨噬细胞胞葬作用
参与心梗后心肌损伤和重构的机制研究
附录、胞葬作用与哪些病理过程有关？
胞葬作用（Efferocytosis）作为一种双刃剑，
既有助于维持机体的稳态，又可能在某些病理过程中引发不良后果
：在健康状态下，胞葬作用通过清除凋亡细胞，防止炎症反应的扩散，维持组织的正常功能；然而，在病理条件下，胞葬作用的失调可能会加剧疾病的进展。
图7 人体主要器官中参与胞葬作用的细胞类型及相关疾病概览[10]
1. 动脉粥样硬化：
在动脉粥样硬化斑块中，凋亡的巨噬细胞不能及时被清除，会导致斑块的不稳定性和炎症反应的加剧。胞葬作用的缺陷会加剧动脉粥样硬化的进展，因而增强胞葬作用被认为是一种潜在的治疗策略。
2. 癌症：
胞葬作用在肿瘤微环境中发挥重要作用，清除凋亡的肿瘤细胞可以防止二次坏死和炎症反应。
然而，某些肿瘤细胞通过表达“don't eat me”信号（如CD47），逃避被吞噬，导致肿瘤的免疫逃逸和进展
。阻断这些信号的研究已成为抗癌治疗的热点。
3. 慢性炎症性疾病：
包括慢性阻塞性肺疾病（COPD）、哮喘和系统性红斑狼疮（SLE）等疾病中，胞葬作用的失调会导致持久的炎症反应，进一步损害组织功能。例如，在COPD患者中，巨噬细胞的胞葬能力下降，导致炎症介质的释放和肺功能的恶化。
4. 肥胖和代谢综合征：
胞葬作用在肥胖相关的代谢性疾病中也起到重要作用，通过清除凋亡细胞，促进巨噬细胞从促炎性M1型向抗炎性M2型转化，维持组织的炎症稳态。胞葬作用的缺陷会导致慢性炎症，进一步加剧代谢紊乱。
参考文献
1. Moon B, Yang S, Moon H, Lee J, Park D. After cell death: the molecular machinery of efferocytosis. Exp Mol Med 2023, 55(8): 1644-1651.
2. Cheng M, Chen S, Li K, Wang G, Xiong G, Ling R, et al. CD276-dependent efferocytosis by tumor-associated macrophages promotes immune evasion in bladder cancer. Nat Commun 2024, 15(1): 2818.
3. Singh S, Bensalem J, Hein LK, Casey A, Mäkinen VP, Sargeant TJ. epHero - a tandem-fluorescent probe to track the fate of apoptotic cells during efferocytosis. Cell Death Discov 2024, 10(1): 179.
4. Raymond MH, Davidson AJ, Shen Y, Tudor DR, Lucas CD, Morioka S, et al. Live cell tracking of macrophage efferocytosis during Drosophila embryo development in vivo. Science 2022, 375(6585): 1182-1187.
5. Cai W, Dai X, Chen J, Zhao J, Xu M, Zhang L, et al. STAT6/Arg1 promotes microglia/macrophage efferocytosis and inflammation resolution in stroke mice. JCI Insight 2019, 4(20).
6. Astuti Y, Raymant M, Quaranta V, Clarke K, Abudula M, Smith O, et al. Efferocytosis reprograms the tumor microenvironment to promote pancreatic cancer liver metastasis. Nat Cancer 2024, 5(5): 774-790.
7. Martin CJ, Booty MG, Rosebrock TR, Nunes-Alves C, Desjardins DM, Keren I, et al. Efferocytosis is an innate antibacterial mechanism. Cell Host Microbe 2012, 12(3): 289-300.
8. Zarrow JE, Alli-Oluwafuyi AM, Youwakim CM, Kim K, Jenkins AN, Suero IC, et al. Small Molecule Activation of NAPE-PLD Enhances Efferocytosis by Macrophages. bioRxiv 2023.
9. Fernandez-Boyanapalli RF, Falcone EL, Zerbe CS, Marciano BE, Frasch SC, Henson PM, et al. Impaired efferocytosis in human chronic granulomatous disease is reversed by pioglitazone treatment. J Allergy Clin Immunol 2015, 136(5): 1399-1401.e1393.
10. Boada-Romero E, Martinez J, Heckmann BL, Green DR. The clearance of dead cells by efferocytosis. Nat Rev Mol Cell Biol 2020, 21(7): 398-414.
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