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【技术专栏】如何对CUT&Tag项目进行质控

伯远生物 · 公众号 · · 2024-03-27 08:55

正文

一、CUT&Tag技术介绍

CUT&Tag （ Cleavage Under Targets and Tagmentation ）是替换传统ChIP-seq技术来研究与目标蛋白质互作DNA的新技术。与ChIP-seq相同的是都需要利用抗体识别并结合目标蛋白，不同点在于CUT&Tag技术是利用Tn5转座酶与Protein A/G的融合蛋白，通过二抗把Tn5酶复合体引导至目标染色质区域，Tn5转座酶在剪切DNA的同时，在插入位点连接adapter，再通过PCR扩增制备文库（图1）。与ChIP-seq相比，CUT&Tag具有显著优势，如：信噪比高，可重复性好，实验周期短（1天实现从细胞到文库构建），细胞投入量低等，尤其适用于早期胚胎发育、干细胞、肿瘤以及表观遗传学等研究领域。

图1 CUT&Tag实验流程图(Kaya-Okur et al., 2019)。

二、CUT&Tag质控

1.CUT&Tag文库质控

CUT&Tag文库的质控是CUT&Tag项目成功的基础，对文库质量进行严格控制可以减少测序成本和生信分析的计算成本。理想的文库质检图是什么样的呢？（如图2所示）可以明显看出两个特征：1）出现不同的峰，分别是约200bp的峰和400bp的峰，分别代表1个核小体的分布峰和2个核小体的分布峰；2）第一个峰高度明显高于第二个峰高度（差的结果如图3所示）。

图2 理想的CUT&Tag质检图。

图3 比较差的CUT&Tag质检图。

图4 对应图2的测序结果Insert size分布图。

图5 对应图3的测序结果Insert size分布图，由于二代测序倾向于检测较短的序列，图中200bp左右区域的峰高于400bp左右区域。

2.测序结果质控

测序仪产出的reads需要经过一系列的质控步骤：1）低质量reads过滤，包括质量分数低的碱基序列和接头污染序列等；2）能比对上的reads评估；3）去PCR扩增产生的reads过滤。最终得到的reads数需要达到20M以上。

图6 测序reads评估结果。

3.peak区域reads占比质控（FRiP）

Peak区域的reads占比越高，说明抗体的俘获效率越高，抗体的特异性越好。一般FRiP值越高, peak的显著性程度越高，背景越低，实验验证成功的比例越高，一般FRiP值5%以上较好。

图7 peak区域reads占比结果。

4.peak数

Peak就是转录因子结合位点或者组蛋白修饰位点，转录因子的peak数几十个以上就可以了，关键是motif是否有显著富集。而组蛋白修饰的peak数一般1万以上，比peak数更重要的是富集位置。

图8 peak数目结果。

5.富集motif

富集motif一般是转录因子结合位点的核心位置（图9），这些碱基的突变会影响转录因子与DNA元件的结合。

图9 motif富集分析结果。

6.Reads富集区域

Reads的富集区域能体现抗体结合位点的特性。H3K4me3和H3K27ac修饰一般富集于TSS附近（图10）。

图10 测序Reads在基因区富集分布。

三、CUT&Tag技术案例

案例一
油松NAC3转录因子下游基因检测

题目： An ethylene-induced NAC transcription factor acts as a multiple abiotic stress responsor in conifer

期刊： Horticulture Research

影响因子 ： 7.2

技术路线：

案例二
玉米MYC2转录因子下游基因检测

题目： ZmMYC2s play important roles in maize responses to simulated herbivory and jasmonate

期刊： Journal of Integrative Plant Biology

影响因子 ： 9.1

技术路线 ：

案例三
小麦染色质组动态变化检测

题目： Dynamic chromatin regulatory programs during embryogenesis of hexaploid wheat

期刊： Genome Biology

影响因子 ： 17.9

技术路线 ：

References ：

Han, F., Wang, P., Chen, X., Zhao, H., Zhu, Q., Song, Y., Nie, Y., Li, Y., Guo, M. and Niu, S., 2023. An ethylene-induced NAC transcription factor acts as a multiple abiotic stress responsor in conifer. Horticulture Research , 10 (8), p.uhad130.

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