工艺和生物反应器的性能直接受到实时监测能力的影响。
了解细胞培养和微生物发酵过程中的细胞生理学、健康和新陈代谢，可以更高效、更具成本效益地生产高质量的生物药物。这些知识指导有关工艺开发的决策，并能够改进生物反应器设计。因此，这两项活动都会影响工艺和生物反应器的性能。
入线监测提供对过程信息的实时访问，极大地提高了对生物过程的理解，从基本过程行为到细胞功能等更高级的属性。因此，它可以显著提高生产率、质量和工艺稳定性，并提高培养运行的性能，通常可以节省时间、材料和人力资源。
对实时过程监测重要性的认识推动了用于跟踪不断增加的过程参数和其它细胞属性范围的解决方案的开发。其中一些解决方案以新的方式利用现有技术，而其它解决方案则是专门为生物反应器内的入线监测而开发的新技术。
确保生物反应器性能
在理想的情况下，可以监测细胞培养和微生物系统中涉及的所有代谢途径。当然，这实际上是不可行的。Cytiva 自动灌流高级产品经理 Melissa Semple 表示，从历史上看，重点是监测三个领域：受控环境、培养基消耗的分子代理和细胞密度。
Semple 解释说，受控环境由生物反应器设备上的传感器表示，例如质量-流量控制器气体流速、搅拌速度、泵速、称重变化、罐压等。确保我们能够控制设备并能够产生所需/预期的条件，”他说。
Semple 评论道，还需要监测环境中对细胞有关键影响的特征，例如 pH 值、溶氧 (DO)，以及在可能或传感器合适的情况下监测溶解的二氧化碳 (CO2)。在微生物发酵过程中，可能还需要通过连续氧化还原传感来监测细胞系的活性氧化物质。
AGC Biologics 研发科学家 Shunsuke Shiina 表示，跟踪这些过程参数是因为它们影响细胞生长、生产力和产品质量。因此，这些数据可用于控制气流速率、搅拌速度、培养基进料速率和 pH 值。“需要大量的传感器来管理培养或发酵过程中最基本的生命支持，并且它们被视为对过程控制至关重要，因为它们监测关键过程参数 (CPP)，”Semple 补充道。
Semple 还指出，这些传感器的重要性推动了它们的不断改进，从而推动了与工艺解决方案持续接触的真正的原位或入线传感器的开发。从这些传感器获得的读数用于快速控制生物反应器装置，并最终控制细胞的培养/发酵环境，工艺环境的管理通常通过自动闭环控制器实现。
Semple 继续说道，分子代理代表细胞生长和能量通常依赖的碳源（例如葡萄糖、谷氨酰胺），以及这些分子的代谢产物（例如乳酸、谷氨酸）和细胞废物，历史上，氨这些分子实际上是最基本和最小的指标，大致代表了培养基成分的供应和消耗。它们为工艺操作员提供了培养/发酵代谢的部分信息，并且一直是工艺优化所依赖的主力读数。”
然而，代谢物读数通常需要收集样品进行离线分析。因此，需要能够在培养物中原位测量这些代谢物（理想情况下还可以测量各种其它代谢物）的传感器，以便能够立即、更连续地读取培养物的健康状况，Semple 表示。
Univercells 产品经理 Clément Dumont 表示，细胞密度受到密切监测，因为必须精确确定密度，才能知道何时执行某些关键工艺步骤，例如转染或感染，这可能对工艺的最终产量产生很大影响。
Semple 说，原位测量活细胞密度和总细胞密度是理想的选择，因为这些数据可用于创建补液控制回路，并能够实时快速响应细胞密度的变化。不幸的是，这种确认通常是通过离线样品的自动显微镜分析来做出的。不过，她确实指出，在大多数情况下，用于生物工艺的原位传感器的、更连续的介电常数读数可以与活细胞密度关联。
入线监测工具
Avid Bioservices工艺开发和制造、科学与技术副总裁 Pramthesh Patel 表示，对 DO、pH、温度、鼓泡、搅拌和 CO2 等常见参数的监测早于现代过程分析技术 (PAT) 的出现，其依赖于早期的分析技术，例如专用探针和传感器。
近年来，Patel 指出，创新 PAT 的出现可以实时监测许多附加参数，从而可以更清晰地了解细胞（在某些情况下细胞内）发生的情况。“最新的监测领域集中在细胞活性、营养和代谢物水平、蛋白质质量/完整性、糖基化和细胞的氧化还原状态，”他解释道。实现这种扩展监测能力的 PAT 包括电容、拉曼光谱、荧光寿命成像 (FLIM) 以及近红外 (NIR) 和中波长红外 (MWIR) 光谱。
Catalent Biologics 生物制剂产品开发科学家研究员 Christopher Kistler 表示：“PAT 工具允许将传统上离线测量的过程属性纳入实时监测领域。”他观察到，电容技术用于根据电信号构建生物量预测模型，用于入线监测代谢物的拉曼/近红外光谱解决方案正在开发中。Sartorius 工艺技术经理 David Ede 重点介绍了用于测定营养物和废物代谢物水平的新型酶探针，并强调拉曼光谱已适用于测量许多不同分析物的浓度，包括谷氨酰胺、氨、氨基酸甚至蛋白质。然而，Dumont警告说，这些代谢物的入线解决方案尚未与所有一次性生物反应器无缝集成。
针对不同生物分子采用不同的方法
为了真正有用，必须根据每个特定工艺的需要选择入线监测策略。“用户首先需要明确他们想要实现的目标，然后才能选择合适的 PAT 系统，”Dumont 表示。“虽然用于基本细胞培养监测的技术通常相当标准，但用于确定最终产品质量和属性的监测参数取决于产品类型，目前不存在用于对这些参数进行入线评估的标准解决方案。”他解释道。
Ede 表示同意，不同的生物原料药类别可能需要不同的生物过程监测方法。化学合成过程通常使用色谱方法，例如高效液相色谱法，而微生物过程则依靠红外技术来测量总生物量。对于主要通过补料分批工艺生产的蛋白质疗法来说，关键参数是代谢物水平和细胞密度。这些可以通过酶探针和电容探针以及拉曼光谱来测量。工艺体积也可能很大，因此可能也需要监测二氧化碳水平。
新颖的药物模式有额外的过程监测要求。Ede 观察到，基于病毒的疗法的生产过程需要测量产品滴度以及完整衣壳与空衣壳的比率，这可以通过各种技术离线确定，例如尺寸排阻色谱步骤后的多角度光散射。与此同时，对于基于细胞的疗法来说，正确的细胞激活或分化状态至关重要，因为细胞是产品。入线传感器可以测量细胞的大小、数量和聚集，但它们可能无法检测细胞的正确分化。行业正在使用拉曼光谱针对该应用进行研究。“多频电容测量将来有可能提供更先进的细胞参数，但目前还没有证据表明它们在细胞治疗中的应用，”Ede 评论道。
Kistler总结道，PAT 工具与预测模型的应用以及分析技术的比较可以实现对原料药的定制入线监测。他还指出，现在可用的 PAT 工具范围可以针对特定类别的生物原料药中进行定制，例如，抗体/细胞系可能需要特定的拉曼模型。
传感器设计的重要性
Semple 表示，原料药的性质也会影响最适合特定过程监测应用的传感器设计。她认为：“被检测分子的形状和性质决定了传感器的设计。”她还指出，传感器技术的早期版本通常以离线形式提供，允许在传感器准备好在无菌条件下使用之前检测关键分子状况。
事实上，传感器经常被重新设计，以便在无菌环境中无缝使用，Semple 说。“这意味着它们需要在暴露于特定的灭菌技术之后保持功能，如用于准备不锈钢生物反应器或发酵罐的在线蒸汽循环，或者用于准备一次性生物反应器耗材的伽马辐照或微波循环。”
原位传感器设计的另一个重要方面是在整个运行期间的连续精度。Semple 还指出，一些传感器设计不会转化为未来用于连续监测的原位设计，例如传感机制中使用的材料在反应中被消耗的设计。“这些传感器，”他说，“只能适应离线形式，即需要从生物反应器中提取离线样品，或者作为近线方案，其中培养物连续分配到传感器。”
提供更大的多功能性
“通过最新 PAT 获得的越来越多的可用信息为药品制造商提供了丰富的好处，无论是在工艺开发之初（当实验是一项关键且通常复杂的活动时），还是当根据既定工艺进行生产时， ”Patel说道。
Patel 指出，优点之一是在设计实验、以确定最佳生产工艺时增加了自由度和多功能性。“如果没有实时监测，每个实验都必须单独仔细进行，然后再进行另一个独立实验，并以在前一个实验中获得的知识为基础。然而，最新 PAT 的强大功能可以实时显示细胞发生的情况。这些技术共同实现了涉及生物反应器内环境动态挑战的连续实验，从而更快、更高效地识别工艺开发的最佳点。”
此外，Ede 表示，PAT 工具可以在工艺的生命周期内提供各种增强功能。他们可以通过测试不同的参数、收集工艺稳健性数据以及利用计算机建模来提高性能，以实现工艺优化。
Ede 继续说道，一旦工艺得到优化和表征，PAT 技术就可以通过为每个参数设置公差区域并应用控制策略将其调整到限制范围内，来实现实时控制。例如，使用 Sartorius 的 SIMCA-online 等程序实时监测过程，可以对可能影响产品质量或产量的任何异常情况提供早期预警，并允许实施自动化控制策略，从而减少操作员错误或无菌问题。“这种方法可以降低产品变化和工艺偏差，”他表示。
Dumont表示，生物反应器设计还可以提高灵活性。他指出了固定床生物反应器，例如 Univercells scale-x 生物反应器，该反应器由捕获细胞的结构化固定床组成。”他解释道。相比搅拌罐反应器，这一设计更容易实现灌流操作，前者需要复杂的细胞截留设备，他补充说，当这一功能与用于葡萄糖测量的 PAT 工具结合使用时，灌流工艺可以在恒定的葡萄糖浓度下运行更长时间，并为细胞提供良好控制的培养基环境。
另外，Univercells 正在实施一种新方法，使用由葡萄糖和乳酸数据提供的相关模型来确定细胞密度，Dumont 指出，该方法强调了使用 PAT 工具与先进数据分析技术相结合进行数据收集的重要性。
不断增加的信心
来自入线工具的实时数据可以提供直接或间接链接到特定工艺参数的数据。Shiina表示，无论哪种情况，这些数据都可以用来改进生产工艺。“从入线传感器获得的信息可以表明补料量和添加培养基的时间是否适合细胞的活动。此外，传感器数据可以实时反馈给操作员和/或生物反应器设备，以控制重要的过程元素，例如氧气和空气的供应、搅拌次数以及pH 值。”他解释道。相信这种反馈循环最终可能由基于人工智能的软件、利用积累的数据和入线测量来控制。
Semple 补充说，连续的传感器数据使操作员能够以更一致的方式控制工艺，从而有可能改善对特定细胞的环境控制，继而使最终工艺在批次之间保持稳健。“最终的结果是人们对开发从质量和产量角度来看更为可靠的工艺的能力更有信心，”他观察到。
Kistler 指出，PAT 工具还在制定决策时将更多数据带入过程决策中，从而增强了人们对这些决策的信心。作为一个例子，他强调了 PAT 工具如何促进补料输送率的精确控制，并提供残留代谢物浓度的即时反馈，从而更全面地评估工艺性能。“PAT 工具可以实现未来的状态，实时访问产品质量数据将允许同时评估过程和产品数据；潜在地提高质量，同时最大限度地减少所需的实验数量。如有必要，可以根据更多信息并在适当的时间内做出决定，以进行路线修正。最重要的是，”Kisstler强调，“过程错误可以在发生时被检测到，并在它们有机会变得灾难性之前得到缓解。”
有助于改进生物反应器设计
使用入线传感器收集的数据的应用范围不局限于工艺优化和控制。Patel观察到，它们还可以用来为增强生物反应器的设计、结构或功能提供策略。作为一个例子，他指出，现有数据可以揭示有助于收集的额外数据，在某些情况下，这可能会创造机会将新探针/技术直接纳入生物反应器设计中，而不是将它们作为附加组件提供。
事实上，Semple 指出，历史上生物反应器设计的一些最重要的改进来自于行业识别对基于细胞的工艺的健康和控制最关键的分子或细胞特征。
“在生物反应器袋设计中提供一次性接口是充分利用这些传感器为工艺带来的好处的关键，同时从长远来看，还可以降低污染风险，”Ede 表示同意。
然而，Shiina表示，至少有一个警告。“使用这些信息进行长期生物反应器设计取决于几个因素，包括生物反应器的规模和形状，以及不断改进的入线传感器的最佳位置和数量。”
Semple 扩展了这一想法：“随着细胞代谢生物学得到更好的理解，更多的培养性能指标正在成为提高细胞培养和发酵结果一致性的关键指标。分子对目标细胞类型的健康或生产力的重要性将决定生物制药行业的重点。传感器在生物反应器或发酵罐环境中“生存”的能力将决定传感器的防止位置，是作为台式传感器或是作为原位传感设备，如果连续培养取样可配合近线传感器解决方案，那么连续取样功能对于某些细胞培养或发酵过程就变得很重要。当新的传感值对于受控过程的功能或一致性至关重要时，就会创建这些解决方案。”
不一定是新技术
专为实时监测而设计的 PAT 工具可以基于新技术，但它们通常利用现有的分析技术来以入线、连续的方式执行。“并不总是需要开发新技术，因为有时可以利用现有技术来解决这些新应用，应用拉曼光谱实时监测产品质量属性就是一个这样的例子，”Kistler说。
Patel 补充道，电容和 FlIM 是最近推出的另外两种主要 PAT，它们并不代表根本性的新技术。“它们都是基于物理学基础的历史悠久的技术。然而，直到最近这些方法才被应用于提高生物制药过程中的监测能力，”他指出。
细胞生理实时监测
随着生物制药解决方案已从基于蛋白质的疗法扩展到包括基因和细胞疗法，客户正在寻求量化更多的分子种类、细胞种类和细胞形式（活/死），以追求受控的生产过程。Semple 表示，傅里叶变换红外光谱 (FTIR) 和场效应晶体管 (FET) 生物传感器解决方案这两种技术吸引了人们对入线实时监测的兴趣。
入线无菌监测的潜力
尚未从入线技术中受益的生物过程检测的一个重要方面是无菌监测。Kistler指出，行业的几个工作组正在研究快速微生物检测能力。“一旦检测足够快速和准确，下一步就是将测试从离线模式中转移出来。”
“如果成功，”Kistler 指出，“这种入线无菌检测将有可能缩短生产批次结束和返回无菌检测结果之间现有的较长周转时间，不仅缩短放行时间，而且使制造商有机会在投入额外的宝贵人力、物力或其它资源之前终止有问题的批次。”
新模式需要新解决方案
随着更多的分子类型通过细胞培养和发酵过程产生，Semple 期望能够监测各种分子（例如蛋白质、病毒、DNA 和 RNA）并能够区分这些分子的各种形式（例如目标蛋白的糖基化状态、质粒 DNA、信使 RNA 等）将产生对额外实时监测解决方案的需求。
事实上，Ede 表示，细胞和基因疗法都需要相关的入线监测解决方案，但目前尚缺乏这种解决方案。“对于细胞疗法，需要能够测量细胞密度、聚集、活性和分化的传感器，以引导细胞进入有利的状态。对于基因疗法，需要能够实时量化产品滴度的传感器，来加速工艺开发并降低 GMP（良好生产规范）生产的风险，”他说。
Dumont 表示，使用固定床生物反应器进行病毒载体贴壁细胞培养和其它基于病毒的疗法也产生了对新的实时监测解决方案的需求。Univercells 正在进行多个项目，其中一个项目专注于使用入线葡萄糖和乳酸测量以及先进的相关模型来预测生物反应器中的生物量。
“采用软传感器进行细胞密度监测具有一些关键优势，特别是在固定床生物反应器中使用时，”Dumont说。他补充说，Univercells 正在开发的模型提供了代表整个固定床的数据，而其它一些测量方法提供了更局部的测量结果，并且不太能代表整个细胞培养物。Dumont表示，该模型在与一系列能够直接放大的生物反应器一起使用时也特别有益，因为小规模创建的模型可以直接应用于更大规模。
技术、验证和其它挑战
虽然用于实时监测生物过程的入线传感正在改善生物反应器和过程性能，但这些解决方案的开发并不是一项简单的任务。Shiina 指出，在一次性系统中引入新传感器和 PAT 工具在优化传感器位置、耐灭菌程序（例如伽马辐照或 X 射线辐照）以及无菌安装方面具有挑战性。他补充说，确认和验证新型入线传感器与离线设备的可比性非常重要，特别是如果在实施新技术时必须首先使用离线分析。
Patel 指出，许多最新的传感器/PAT 工具可能容易受到光干扰。这一属性带来了挑战，因为塑料一次性生物反应器的避光能力不是特别好。他说，另一个问题是一次性生物反应器只能容纳一定数量的探针，这可能会限制 PAT 的使用数量。
Patel 表示，还必须考虑在生物反应器基质环境中验证新传感器/PAT 工具的性能。“最新的工具是在相对原始的环境中开发和测试的，可以专门关注正在分析的目标。然而，生物反应器中填充有多种材料的混合物，其中任何一种都可能影响传感器或探针的性能。了解这一挑战并制定确保这些设备准确运行的流程至关重要，”他解释道。
此外，Dumont 强调 PAT 系统需要无缝集成到客户环境中。“一个工艺流程通常结合了不同供应商的不同设备。正在引入的新 PAT 系统的标准化至关重要，”他指出。新系统还必须在各种条件下提供适当的测量，以便它们可以用于不同的过程，并以灵活的方式与不同的设备相结合。
其它问题包括可放大性的需求以及传感器寿命和校准的管理。Kistler指出，在一次性系统中，最终用户无法操纵传感器。“该行业正在朝着传感器与袋膜集成的方向发展，使传感器仅在组装时进行校准。传感器需要在整个产品生命周期中保持稳定，从灭菌到包装、运输，再到最终的生产批次使用，”他说。
合规性需求也会造成障碍。例如，Semple 评论说，原位传感器设计必须考虑对活细胞的影响、化学相容性、颗粒生成以及与工艺液体接触时的可溶出/可析出特征的监管要求，即使这些液体稍后要进行纯化。Ede 补充说，一次性传感器是受监管产品和 GMP 流程的一部分，每次推出前都需要严格的测试和认证，这可能会延长开发时间。
数据管理与分析
PAT 工具必须得到适当的数据管理和分析解决方案的支持，以确保所收集数据的最大效益。“为了使 PAT 工具中的所有信息发挥作用，基础设施必须到位，以分析和处理数据集，而这一考虑因素常常被忽视，”Kistler 指出。
Ede 表示同意，“为了充分利用生成的数据，您需要将其反馈到流程中。”其中包括允许执行多元数据分析 (MVDA)、模型创建以及通过实时批量监测检测过程异常的工具。还需要控制软件来连接各种过程知识来源，设置工艺策略，然后将这些策略链接到必要的执行器，例如泵、搅拌器电机和阀门，”他补充道。
Kistler 表示，将数据转化为有用信息所需的其它因素包括从 PAT 工具访问信息的能力、将过程和 PAT 数据集成在一起、将数据移出生产车间所需的网络以及技能组合需要开发模型。
事实上，AGC Biologics 非常重视开发过程信息系统，以收集入线监测数据并将其链接到过程控制。Shiina 表示，该公司还希望部署来自拉曼光谱传感器获得的培养基中许多物质的波长的 MVDA。“特别是，我们预计从 MVDA 获得的信息将用于控制关键组件，”他说。
访问以前未知的信息
Patel 强调，生物制药过程中实时监测的全部目标是解开科学家之前的黑匣子 - 生物反应器内的细胞和环境实时发生的情况。“虽然我们在构建黑匣子窗口方面取得了巨大进步，但盲点仍然存在。为了解决这些剩余的盲点，我们需要创建额外的窗口（探针/PAT）来提供更高的精度和灵敏度，”他认为。
对于Patel来说，“我们能取得的最重要的进步是能够实时监测和分析生物反应器内细胞的生理学，以及实时、很好地控制产品质量。这将使我们能够窥视细胞内部并查看转录/翻译活动，以及细胞的整体能量状态。最终，这将帮助我们了解最能让细胞‘快乐’的条件，并使我们能够重新创造这些条件，来优化生物制药工艺。”
“我们对生物制药开发过程中的生物和分子过程的了解越深入，我们对工艺过程的控制就越有力，工艺的一致性就越高。最终，我们对生物工艺的理解将减少批次损失，减少根据过去的实验开发新工艺所需的运行次数，并带来更具响应性和可持续发展的行业。这些成就只能通过对受控生物过程的因果性质的深刻理解来实现，”Semple 总结道。
原文：C.A.Challener, Advances in Inline Monitoring for Improved Bioreactor Performance. BioPharm, 2023.
