首次发现！饶毅团队再取进展

iNature · 公众号 · · 2024-07-01 10:43

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剖析行为背后的神经回路是神经生物学的中心主题。 之前提出了化学连接组(CCT)的概念，以涵盖生物体中神经元和靶细胞之间的整个化学传递，并通过针对果蝇中所有与CCT相关的基因创建了研究它的工具(CCTomics)。

近期，饶毅团队在 eLife 在线发表题为“ Conditional chemoconnectomics (cCCTomics) as a strategy for efficient and conditional targeting of chemical transmission ”的研究论文，该研究在修改GFP RNA干扰、Flp-out和CRISPR/Cas9技术后， 以有条件的方式创建了靶向CCT的细胞系。 这三种策略都被证明是非常有效的，其中使用染色质肽融合的Cas9变体和支架优化的sgRNA效果最好。

作为原理证明，该研究对时钟神经元中CCT基因表达谱进行了全面的交叉分析，发现了时钟神经元中存在的43个CCT基因。从时钟神经元中特异性消除这两种神经元表明，两个后背时钟神经元(DN1ps)或其受体(CNMaR)中神经肽CNMa的缺失导致早晨活动提前，表明CNMa-CNMaR对早晨预期的抑制作用，与PDF-PDFR对早晨预期的促进作用相反。 这些结果证明了条件CCTomics及其工具的有效性，并建立了CNMa-CNMaR和PDF-PDFR信号在调节早晨预期中的拮抗关系。

另外，2024年2月2日，首都医科大学/北京大学/饶毅团队（自振滔为第一作者）在 Science Advances 在线发表题为“ Discoveries of GPR39 as an evolutionarily conserved receptor for bile acids and of its involvement in biliary acute pancreatitis ”的研究论文， 该研究报告了两种G蛋白偶联受体，GPR39和GHSR，介导了细胞对BAs的反应。 该研究揭示了GPR39作为BAs的一个保守的受体，尤其是对3-O-磺酸化的草酰胆酸具有作用。在培养的细胞系中，GPR39足以介导BAs诱导的Ca ²⁺ 升高。在胰腺腺细胞中，GPR39介导了BAs诱导的Ca ²⁺ 升高和坏死。此外，GPR39敲除小鼠中由BAs引起的AP显著减少。总之，该研究提供了体外和体内的证据，证明了GPR39在介导BAs信号传导中的必要性和充分性，突出了其在胆汁性AP发病机制中的作用，并将其作为胆汁性AP的一个有希望的治疗靶点（点击阅读）。

许多研究工作都是为了揭示特定行为背后的神经回路的连接和信号通路。 回路剖析策略包括基因筛选、基因标记、回路追踪、实时成像、遗传传感器和通过电子显微镜(EM)重建中枢神经系统。近年来发展了化学连接组学(chemoconnectomics, CCTomics)，致力于构建一套全面的化学连接组(chemoconnectome, CCT)基因敲除和敲入工具线，以剖析基于化学传递的神经回路。

每种策略都有优点和缺点。 例如，基因筛查的偏见较小，但效率低下；用病毒追踪回路提供了连接信息，但往往容易出现表达泄漏和标记不准确的情况；EM重建在解剖学上是准确的，但不允许操作相应的神经元。CCTomics通过允许CCT基因的行为筛选和相应神经元的准确标记或操作，克服了先前策略的局限性。然而，某些CCT基因的敲除在发育过程中可能是致命的，并且CCT基因在不同的神经元中可能具有不同的功能，这需要细胞类型特异性的操作，这仍然是有限的。

cCCT基因图谱及cCCT组学原理（图源自 eLife ）

在DNA/RNA水平上，体细胞基因诱变主要有三种策略：RNA干扰、DNA位点特异性重组酶和CRISPR/Cas系统。 RNA干扰可以方便有效地靶向RNA。转基因RNAi果蝇的文库已经建立，几乎涵盖了果蝇的整个基因组。DNA位点特异性重组酶如Flp、B3和Cre介导特异性和高效的基因编辑，这是一项耗时且相对复杂的基因分析重组。CRISPR/Cas系统，特别是CRISPR/Cas9，其靶向具有sgRNA/Cas蛋白复合物的DNA，在过去十年中被广泛应用于基因操作。 CRISPR/Cas 9在果蝇体细胞基因操作中的广泛应用始于2014年。此外，已经建立了靶向激酶和GPCRs的UAS-sgRNA文库，但目前还没有覆盖所有CCT基因的sgRNA文库。 CRISPR/Cas9的有效性尚未在果蝇神经系统中得到系统验证。

昼夜节律可用于cCCTomics的原理验证测试。 生物进化出周期性的行为和生理特征来响应周期性的环境变化。例如，果蝇的节律性运动行为在光-暗(LD)循环中，分别被称为早晨和晚上预期，在灯被打开和关闭之前显示出增强的活动。在12小时暗- 12小时暗(DD)条件下，活动大约每24小时达到峰值。大约150个时钟神经元、昼夜节律输出神经元和时钟外电振荡器(xCEOs)协调果蝇的昼夜节律行为。在分子水平上，PDF和PDF受体(PDFR)是众所周知的，它们的突变体表现出较早的夜间活动高峰，而没有早晨预期。其他神经肽及其受体，包括 AstC/AstC-R2和神经肽F (NPF)及其受体(NPFR)，也被报道调节夜间活动，而CCHa1/CCHa1-R和Dh31调节早晨活动。 到目前为止，在果蝇中还没有早活动表型的报道。

为了开发一种更有效的体细胞基因操作方法，研究人员生成了两种CCT基因条件操作系统 ：(1)基于GFPi/Flp-out的CCT基因条件敲除(cKO)系统(cCCTomics)和(2)基于CRISPR/ cas9的(C-cCCTomics)。这两种系统都在果蝇神经系统中实现了高效率的基因诱变。C-cCCTomics利用染色质肽融合Cas9和支架优化的sgRNA，使高效的条件基因敲除像RNAi一样简单。 C-cCCTomics在时钟神经元中的进一步应用揭示了CCT基因在昼夜节律行为中的新作用：CNMa-CNMaR作为PDF-PDFR的拮抗信号调节早晨预期。

参考消息：

https://elifesciences.org/articles/91927

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