来源 | NIRO（ID：NIRO-keyanmiao）
编辑 | 澹泊研究僧
今天想聊聊蛋白表达中，常遇到的一个问题就是
“
需要的是全长蛋白，发现有截短产物，是怎么回事呢？
”
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对于这个问题，我们先了解一下蛋白表达相关知识点！
蛋白表达
(protein expression)即重组蛋白表达，是指通过将目的基因重组克隆到人工载体(vector)上，再导入受体细胞或无细胞体系，在异源系统表达为蛋白的技术。
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主要分为四个基本步骤: 转录、剪接、转译和后修饰。
(1) 转录:
主要是从DNA到RNA的过程，也是基因表达的开始。所以可以从基因组中找到蛋白质编辑基因，然后根据已知信息，将其转录成RNA片段。
(2) 剪接:
一种对RNA进行修饰的步骤，只在转录后发生，能够从RNA片段中切割出有用的蛋白质编码区域。
(3) 转译:
是从DNA到蛋白质的过程，通过将RNA片段中的碱基对一一对应转换成氨基酸来实现。
(4) 后修饰:
指在蛋白质表达过程中细胞内和细胞外发生的一系列加工反应，这些加工反应有助于完善和活化蛋白质的结构和功能。
2. 蛋白表达的影响因素
(1) 蛋白本身的特性:
如蛋白分子量大小、蛋白物种、是否为毒性蛋白、蛋白翻译后修饰程度以及结构的复杂程度等。
(2) 宿主选择:
宿主本身的特性以及蛋白表达需求等会影响蛋白表达。
由于蛋白应用范围对应的需求量不同，所以要根据需求量确定表达系统。
表达系统的选择可以看这篇文章《
膜蛋白表达，选对系统很关键！
》。
(5) 表达系统的优化:
选择好的表达系统很重要，同时样本的选择和处理也需要非常小心，以确保实验结果的可靠性和可重复性。
通过了解蛋白表达的基本知识点后，我们来详细了解为什么蛋白表达会出现截短产物吧！
所谓，
截短产物(truncated product)就是在蛋白表达过程中指的是由于各种原因导致蛋白质未能完全合成到预期的全长，而是提前终止合成的较短肽段。关于图片中的WT和Mutant是什么意思？可浏览这篇文章《
为什么WT代表「野生型」？
》。
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一般蛋白表达出现变短的目的蛋白主要原因有
蛋白酶降解、翻译起始问题、密码子使用偏好性以及温度有关
。
1.
蛋白酶降解
(1) 细胞内蛋白酶活性:
尽管常用的BL21宿主菌是lon和ompT蛋白酶基因缺失的，但待纯化蛋白在细胞裂解前后仍有可能发生降解。这可能是由于细胞内仍存在其他能够降解蛋白的酶类。
因此可以通过Western杂交比较SDS-PAGE上样缓冲液加热处理的全细胞和细胞裂解物来加以辨别。
(2) 细胞裂解过程:
在细胞裂解时，如果未添加蛋白酶抑制剂(如PMSF)或未保持细胞裂解物低温，可能会导致蛋白进一步降解。
2. 翻译起始问题
另外一种截短蛋白出现的可能是在靶基因内存在第二个翻译起始点。
起始密码子AUG (Met) 的上游在RNA编码区有类似于核糖体结合位点序列(AAGGAGG)的间隔序列(通常是5–13个核苷酸)时，容易出现这种问题。
截短蛋白在纯化全长蛋白的操作时往往造成麻烦。解决途径之一即是选用两端都带有融合标签的pET载体，例如pET-28和pET-30系列载体在N-端和C-端都有His-Tag。这样，全长蛋白就可以通过提高咪唑浓度，在洗脱时将截短蛋白与全长蛋白区分开。pET-29和pET-30系列载体在N-端融合有S-Tag序列而C-有His-Tag，因此可以先后用固定化S-蛋白和His- Bind树脂亲和纯化以获取全长蛋白。
3. 密码子使用偏好性
原核表达系统和真核细胞偏爱的密码子不同。在用原核系统表达真核基因时，真核基因中的一些密码子对于原核细胞来说可能是稀有密码子。这些稀有密码子的存在可能导致表达效率和表达水平降低，甚至产生截短蛋白。
4. 其他因素
(1) 表达条件:
表达温度、IPTG浓度等表达条件也可能影响蛋白的表达和稳定性。例如，高温可能导致蛋白变性或降解，而低浓度的IPTG可以减少化学物质对细胞的损伤。
(2) 培养基成分:
培养基中的某些成分(如葡萄糖)可能抑制蛋白的表达，导致表达的蛋白与预期的不同。
(1) 优化表达条件:
通过梯度改变表达温度、IPTG浓度等条件，寻找最适的表达条件。
(2) 添加蛋白酶抑制剂:
在细胞裂解时添加蛋白酶抑制剂，并保持细胞裂解物低温，以减少蛋白的降解。
(3) 选用合适的载体和菌株:
选用两端都带有融合标签的载体(如pET-28和pET-30系列载体)，以便通过提高咪唑浓度在洗脱时将截短蛋白与全长蛋白区分开。
(4) 选用能够补充稀有密码子tRNA的菌株(如Rosetta 2系列)，以提高真核基因在原核系统中的表达效率和水平。
