Angew：通用crRNA酰化策略用于稳定的光启动CRISPR-Cas12a系统一步式核酸检测

作者：苏打水

近日，湖南师范大学杨荣华教授、熊二虎教授团队在 Angew. Chem. Int. Ed .中发表论文，报道一种简单无需改变序列的通用性核酸检测手段，通过将光响应基团连接到crRNA的2’-羟基（2’-OH）上以调控crRNA引导的Cas酶活性，并将其应用于核酸检测。

光激活的CRISPR-Cas系统能够更好地从空间和时间维度上调控crRNA引导的Cas酶活性，现有体系中，光响应基团的修饰位置和数量往往受制于靶标核酸序列，即当更换靶标核酸时，需要对整个光控体系进行重新设计和优化，通用性比较差，限制了光激活CRISPR-Cas系统的应用。因此作者旨在发明一种简单无需改变序列的通用性核酸检测手段 ¹ 。2’-羟基(2’ -OH)是RNA核糖中的一个特征性官能团，与序列无关，最近的研究表明，使用酰基咪唑试剂可以通过2’-OH基酰化(“隐形”)破坏RNA的结构和功能，并在外部添加化学试剂时通过去除酰化加合物(“解隐形”)有效地恢复RNA的结构和功能 ^2,3 。crRNA的功能可以通过在2’-OH基团上附着光响应基团暂时封存，随后通过特定波长的光照射恢复。作者从该点切入，研究酰化策略，开发了多功能光启动一步式CRISPR核酸检测方法。

首先，作者合成了光笼剂，用于修饰crRNA链的2’-OH基团，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）验证了crRNA的笼化以及光诱导脱笼过程，而后又使用365 nm紫外灯照射完全隐藏的crRNA，充分证实了光响应基团的引入都能有效抑制crRNA的功能，并在短时间的紫外光照射下快速恢复CRISPR-Cas12a的活性（Figure 1）。

接着，作者就crRNA的笼化和光诱导脱笼对CRISPR-Cas12a系统的影响进行了探究。crRNA的显著酰化和有效的光诱导去酰化使控制CRISPRCas12a系统的活性成为可能。Cas12a属于DNase酶，在识别目标后，Cas12a可以诱导目标双链或单链DNA (dsDNA或ssDNA)的位点特异性顺切，Figure 2a显示crRNA隐形时抑制了CRISPR-Cas12a系统的活性，而光诱导的crRNA解锁恢复了CRISPR-Cas12a系统的活性的原理图。为了初步评估隐藏的crRNA是否可以抑制Cas12a的顺式和反式切割活性，作者进行了PAGE和荧光动力学分析。Figure 2b观察到随着酰化时间的增加，Cas12a与被遮蔽crRNA偶联的裂解产物逐渐减少，表明酰化诱导的顺切抑制作用。Figure 2c表明crRNA的酰化对  CRISPR-Cas12a系统的反式切割活性也有显著的抑制作用。接下来评估了Cas12a与被遮蔽的crRNA的偶联是否会在光照下显示出恢复的活性，如图Figure 2d，e所示，随着光照射时间的延长，反式裂解活性逐渐恢复，且仅需60 s光照射足以恢复CRISPR-Cas12a的活性。为了阐明光诱导恢复CRISPR-Cas12a活性的普适应，分别对另外7个具有不同间隔区域的原始crRNA进行一步酰化反应，观察到类似的对CRISPR-Cas12a活性的抑制和恢复作用（Figure 2 f-h）。

在研究了酰基化策略在控制CRISPR- cas12a活性方面的有效性之后，接下来作者建立了光启动的单管CRISPR测试方法(Robust One-pot Testing, POIROT) ，研究其核酸检测性能（Figure 3a）。使用等温核酸扩增技术（recombinase polymerase amplification , RPA）生成扩增物，用于后续的CRISPR反应。从Figure 3b-d中观察到对原始和光诱导的未隐藏crRNA的合成靶DNA的检测性能相似。Figure 3e的成分去除实验证明即使添加了所需的所有成分，在没有紫外线的情况下也不会产生荧光信号。然而，光照射后可以产生相当大的荧光信号。进一步地，结合逆转录- RPA (RTRPA)反应构建检测 (SARS-CoV-2) RNA标准的POIROT。分别利用原始crRNA(两步法和常规一步法)和隐藏crRNA (POIROT)检测SARS-CoV-2核衣壳蛋白基因(N基因)，探讨了两步法、常规一步法和POIROT检测性能的差异。如Figure 3f-j所示，POIROT具有与两步法相当的优异分析能力，检测限为1 copy/μL，比传统的一步法检测法高近两个数量级。