细胞无标记检测技术通关宝典

活细胞无标记技术是近年来发展迅猛的实验技术，目前许多前沿的细胞生物学、医学实验室、制药类公司通过这种方法研究活细胞，而不用担心荧光标记是否会造成二次影响。研究人员希望尽可能在接近生理条件下进行活细胞分析，进而无标记技术在活细胞研究方面扮演的角色愈加重要。目前无标记技术主要包含电阻抗检测、成像检测等多种检测技术。

电阻抗检测

ACEA Biosciences公司通过xCELLigence实时细胞分析（RTCA）技术来提供无标记分析，它检测电阻抗，以评估细胞与培养板的粘附程度。电极整合在一次性的E-Plate微孔板底部，实时检测电阻抗。因此，细胞数量、粘附和形态的变化都可以检测到。这种技术广泛应用在多个领域。

例如，xCELLigence RTCA Cardio系统就可以监控心肌细胞的自发跳动，用在心脏不稳定药物的治疗过程中。他们第二代的CardioECR系统还包含场电位电极，可监控电活动，并提供刺激性的起搏功能。据ACEA Biosciences全球产品经理Leyna Zhao介绍，研究人员可研究心脏病患者的细胞，查看心肌细胞的形态、跳动功能和电活动，这样就能筛掉对心肌细胞有不良影响的化合物。

随着越来越多的癌症药物以抗体或免疫细胞疗法的形式出现，研究人员也在寻找一种分析，以检测抗体或免疫细胞的功效。ACEA Biosciences的技术也提供了一种自动化的均质筛选平台，可捕获免疫细胞杀死特定癌细胞的动力学。“研究人员希望有一种分析能预测改造后的T细胞，如CAR-T细胞，是否在癌细胞上有良好的功效”。当免疫细胞加入附着在电极板上的肿瘤细胞时，这种分析利用电阻抗来测定细胞死亡。由于免疫细胞不附着，它们不会对电阻抗产生影响。

然而电阻抗方面的局限性是无法“看到”细胞，一些细胞重要的形态、结构、甚至细胞内部的变化无法通过此种方法得到数据。而且对于悬浮细胞、甚至特殊的贴壁细胞电阻抗方法检测也无法实现。

成像技术

基于细胞成像的分析技术一般需要使用荧光染料进行标记或细胞进行固定，一些荧光标记可能对活细胞具有毒性。无标记细胞分析技术使得研究者既无需耗时耗力的染色流程也无需担心染料对正常细胞活力的影响，就可以计算出细胞数目、细胞汇合度、细胞厚度、细胞体积等形态与结构的量化分析。目前某些高端的成像技术甚至可以对活细胞进行全场相位定量，这种非侵入性的工具，无需染料或标记，即可对细胞查看细胞的细胞核、溶酶体、高尔基体等亚细胞结构、甚至细胞骨架进行量化研究。

目前，比较常见的主要有以下三类定量无标记成像技术：

1、通用型定量相位成像技术

Phasics提供了一种新的光学显微镜观察活细胞的定量相位成像技术，无需任何标记即可对细胞的演化运行精确的统计分析（包括细胞迁移、生长、胞内过程…）。这个简单的即插即用相机模块SID4bio（C-mount连接显微镜），依靠四波横向剪切干涉专利技术，可直接检测透过任何生物样品的透射光的相位信息。SID4bio对普通显微镜升级后可极大增强镜头强捕获样本相位的能力，使半透明样本如细胞、组织有极高的对比度。更重要的是Phasics的图像亦可与荧光通道无缝匹配，例如下面用于溶酶体定位和测定特异相位特征的案例。

       
线粒体GFP标记荧光成像  

 
Phasics相位图像

研究使用了野生型的COS-7细胞系。SID4bio模块插入传统明场显微镜，配备了卤素光源。使用近红外滤镜对光源过滤，以使通过的相位光和荧光能有效耦合。SID4bio是消色差的，可与任何波长滤光片适配且不会产生额外的荧光误差，两张光学图像可同时获取。最终的耦合图像的统计分析表明，溶酶体的相对折射率相比其他囊泡是不同的，Phasics的定量相位图像可有效区分溶酶体与其他囊泡差异。

耦合相位与荧光图像，溶酶体为红色（RFP标记），其他囊泡为灰色。   
溶酶体的相对折射率指数（RSI）不同于囊泡。

此外Phasics创新应用还涉及到细胞有丝分裂中细胞干物质量的测定。首先，测定单个细胞在有丝分裂不同时期的干物质质量，其次是通过分析群体细胞以确定有丝分裂的比例。研究早已证明细胞的相位特征与干物质重量称正相关，通过测定细胞表面的相位参数，Phasics可获得细胞的细胞的干物质质量。此外，由于使用普通的光源照明，因此可用塑料材质的培养皿或孵育器直接成像或进行延时成像，由于细胞无需标记，细胞的各项生理特性完全是生理状态下最真实的，Phasics非常适合细胞的动态研究。

如下研究同样使用了野生型的COS-7细胞系。Phasics是领域内全新的技术，可以同时测量了大量的细胞。首先通过秋水仙素将细胞阻挡各个分裂期。通过细胞分割，对细胞干物质量和相关表面做细胞群体统计分析，进而建立一个判定细胞的分裂状态客观数值的标准。该标准将用于分割的COS-7细胞以确定细胞的有丝分裂统计值。不同的细胞系有不同的标准，例如COS-7细胞，HeLa细胞和RPE细胞等。通过设置对照细胞，可精确的得到目标细胞组精确统计数据。

通过在两个细胞周期测定单个野生型COS-7细胞干物质生长率变化（32小时的延时成像）-40×物镜，细胞分割在一个细胞周期内COS 7细胞表面与干物质量的统计分析

除了以上两个经典应用外，Phasics的相位定量技术还广泛应用于细胞形态（表面，细胞核大小）、细胞跟踪（运动性、增殖）、细胞监控（单个细胞的生长率、存活、分化，细胞发生凋亡）、细胞光学密度（分布，峰值，剖面）、快速无标记组织成像等方面，无需特殊样本制备、无需特殊细胞培养耗材、无需购买额外的成像设备，只需在原有显微镜上简单升级，可以说Phasics是目前最“平易近人”的无标记活细胞成像技术。但Phasics存在一些无法克服的问题。

2、无标记3D活细胞成像技术

因此，在2015年的生命科学十大创新产品之一，突破性的显微成像技术-3D Cell Explorer，这是一款高速、高分辨率且非侵入性的工具，无需染料或标记，即可查看细胞的溶酶体、囊泡、线粒体、细胞核、高尔基体和细胞核等接机构。这款仪器让您能在几秒钟之内记录令人惊叹的活细胞3D图像，且分辨率远高于传统的显微镜，极限分辨率为75nm，为第二个突破200nm光学衍射极限的光学成像技术。

3D Cell Explorer的分辨率也许不如电子显微镜高，但它能评估细胞对外界的反应，这要归功于专利的活细胞360°断层扫描技术。通过全息和旋转扫描的组合，此系统能够检测激光透过细胞时的相对散射光折射率指数的变化，即细胞内物理折射率（RI）的4D分布。在观察样品时，只需2s，用户可创建细胞的3D图像，延迟不到1s。是的，这项技术是专门定位于无标记活细胞3D结构，这项技术的用途还在不断地开发中，科研工作者已使用它来研究微生物与细胞的相互作用，纳米颗粒的吸收和定位，形态变化的实时监控，以及细胞间相互作用的实时监控等，也可用来观察药物对细胞的作用。

要以高分辨率成像一个神经元那样的复杂活细胞并不容易。目前人们所使用的方法都或多或少存在一些局限，生物学家们一直期望以电镜的高分辨率来研究完整的活细胞，然而电镜条件对活细胞有毒性，而光学显微镜的分辨率又受到光学衍射极限的限制；尽管超分辨率显微镜可以规避衍射极限，但这类方法对细胞也并不友好，而现在可通过这一技术解决相关问题。这一成果最初发表在Nature Photonics杂志上，“使我们可以直接观察活细胞，不需要对细胞采取介入性措施，就可以获得足够的对比度。”同时，这也避免了引入染料或标记所带来的潜在危害。随着曝光时间的增加，发光的荧光物质会对细胞产生光毒性。不仅无需染料，而且曝光时间特别短，因此对细胞非常友好。这意味着可以对活细胞进行长期的高分辨率研究。“2D图像只是细胞的阴影，而不是整个细胞，3D能够为我们提供更加真实的信息。”这对于复杂的细胞活动来说非常重要。以神经元为例，其他成像技术很难在活体内观察到，学习和记忆过程中发生的突触可塑性，而此技术能够通过重建3D细胞影像来展示这一过程。

神经细胞普通相差图
2色荧光标记神经细胞图
神经细胞无标记3D图，色彩为数字化染色

3D水凝胶基质目前广泛用于组织工程的微器官系统，药物输送，细胞毒性试验，药物筛选、以及用于细胞的生理，干细胞分化，肿瘤模型和细胞外基质之间的相互作用机制等研究。免疫荧光结合共聚焦显微镜是用来研究细胞嵌入3D凝胶基质中最常用的方法。然而，凝胶基质会影响化学分子的通过性，导致增加抗体用量和孵育时间；3D凝胶基质和抗体之间的相互作用也可能产生错误标记，产生非特异性信号。3D Cell Explorer突破这些限制，无需使用荧光标记，可快速、准确的对嵌入藻酸盐微珠的细胞进行成像。

直径100μm琼脂糖微珠封装的mESs（小鼠胚胎干细胞），相差和荧光成像。
HeLa细胞封装在藻酸盐微珠的DMEM悬浮溶液中，无标记3D成像。

循环肿瘤细胞CTC细胞的检测，CTC细胞具有高异质性，每个细胞可能具有显著不同的尺寸，形状，和免疫表型分布；而且非常脆弱，很可能在标准制备过程中损伤或破碎，进而导致不准确甚至错误的结果。普通显微镜技术样本需要固定与染色，使样品质量降低，并增加了错误结果的风险。3D Cell Explorer检测分析CTC，可保证CTC细胞的最高活性和完整型，不需要固定或标记荧光标记物。

A549（红色箭头）：大圆形细胞一般都是多核（2-3核）；外周血单个核细胞（PBMC），有两种不同类型：圆形和扁平的形状并且粘附于容器底部（绿色箭头）或小浮动的球形细胞，其特征是具备异质性与RI非常高的核区域（蓝色箭头），一般只有一个极好识别的细胞核。

不过，目前3D Cell Explorer技术还存在着一定的缺陷，例如时间分辨率。在这项研究中，一次全息信息获取需要2秒以上。此外，仪器使用的光源是激光器，虽然功率极低，但如何取舍波长与分辨率仍需要优化，长波长对活细胞的光毒性会更少，不过这样就势必牺牲一定的分辨率，需要操作者进行适当取舍。此外，此技术暂时无法叠加荧光通道而且获取全场定量中的细胞干物质量等信息，因此此技术所有很大的应用前景，目前仍然需要与其它技术进行连用，综合解决与研究细胞生命活动中的重要现象。

3、量化无标记3D与荧光覆盖技术

目前最完善的无标记3D成像技术属于PHI公司，该公司的Spatial Light Interference Microscopy（SLIM），是目前最为敏感的光学干涉技术，提供无标签、定量和实时成像的活细胞结构与动力学工具，可对细胞进行全场相位定量，样本相位分布转换为光学路径差异，并将它们最终转换为厚度、干物质量密度、折射率地图。SLIM模块通过C-mount可以附加到所有主要品牌的光学显微镜（10×到100×的放大倍率）并实现多通道荧光无缝匹配，仅使用显微镜的白光照明作为光源。通过Z轴堆叠可实现3D结构构建，并实现15 fps的高速获取。

SLIM是一个广泛的定量成像解决方案，可以相机最高分辨率进行大群体细胞的拍摄（如2 mm FOV for 10X objective at 4.2 MP分辨率）或进行宽视场光学切片（如850 nmz轴分辨率100X / 1.4na物镜）进行三维成像，定量干涉模块可与显微镜荧光通道完全无缝覆盖。

神经元和神经干细胞由于本身非常脆弱，很容易受到温度，化学分子和光的损害，一直以来很难进行理想的成像研究。SLIM的高速获取能够检测到神经元之间的物质传输，而宽视场的视图能够对神经元网络的形成进行完整成像，因此，无论是对单个神经元细胞还是群体水平，SLIM都能实现卓越的成像效果。

海马神经元细胞的轴突中物质的运输。物镜为ZEISS 的Plan-Neofluar 40X/0.75。
神经元生长以及神经元网络出现的动力学研究，追踪细胞的干物质量。

神经细胞分化，可用于更为脆弱的祖神经细胞成像。神经祖细胞在0天（左）和成熟细胞14天（右）。

成像中的每个像素的强度是衡量通过样品的光程差（以弧度的形式），即相移图（phase shift map），测量灵敏度优于0.5纳米。当使用高NA物镜，SLIM的白光照明提供了一个特殊的光学切片的效果，成像厚度近1μm的切片。换句话说，样品实际上被切成薄片，每一片都是按顺序进行成像扫描，最后通过Z轴堆叠实现3D成像构建。

HT-29 3D断层扫描图，使用x63/1.4NA 油镜检测，140张图片的z轴堆叠，每个切面为640x640分辨率。

SLIM也被应用于存储的红细胞的生物化学、结构和功能变化的研究。红细胞膜细微的变化可通过SLIM成像系统纳米级的灵敏度进行可靠的检测红细胞膜的波动。这些波动直接关系到细胞在微血管氧运输能力。借助SLIM的无标定量分析技术，可以快速直接的检查存储血液的质量及优化血液储存条件，以避免血站珍贵血液的浪费。

随着贮藏时间的延长平均相位波动逐步降低，表明随着贮藏时间细胞变形逐渐减小，即相差位移降低，细胞变硬，干物性能减弱，细胞受损。

此外，SLIM还开创了细胞骨架无标记研究的先例。细胞骨架的维持主要是靠肌动蛋白和肌球蛋白，传统研究细胞骨架的方法基本都是通过荧光标记这两种蛋白，SLIM根据肌动蛋白和肌球蛋白的空间相位差异的不同即可进行量化追踪。

SLIM非标记成像与荧光标记肌动蛋白和肌球蛋白骨架成像，获取的细胞骨架叠加，两种成像方式骨架结构完全重合，且SLIM根据肌动蛋白和肌球蛋白的空间相位差异的不同，可以很好的区分这两种蛋白，以研究不同条件下细胞骨架构成的变化

相对传统DIC，Phi Optics的SLIM量化成像系统可清晰地无标记成现细胞骨架

样品制备的“解放”

样品质量对于传统显微镜、荧光成像和超高分辨率显微镜而言特别重要。 “显微成像技术很难克服样本制备出现的问题。” 但是无标记活细胞成像的出现将样本制备的要求降到最低，让研究人员真正从样品制备中解脱出来，“任何细胞组分都有着不同的折射率，利用不同折射率，对细胞组分进行数字化“染色”，细胞核、细胞质和细胞器可轻松区分。这样使用前几乎不需要样品制备。”以往需要昂贵的试剂和花费数个小时的工作，现在通过无标记成像只需几分钟即可得到完美的结果。