Nature Nanotechnology：靶向骨髓细胞区室的天然脂质载体！

奇物论 · 公众号 · · 2025-02-09 22:15

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核酸类药物在临床应用中的潜力在很大程度上取决于递送技术，这些技术可以防止载荷药物过早降解，同时主动将其递送至目标细胞。在过去的几十年里，脂质纳米颗粒（LNP）技术的出现使第一个小干扰 RNA （siRNA）治疗药物的临床转化成为可能，涉及肝细胞中的基因沉默以治疗遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性。此外，LNP 技术对于 COVID-19 信使RNA （mRNA）疫苗至关重要，并促进了目前正在进行临床评估的体内基因编辑方法。为了靶向肝脏以外的组织和细胞，现已经开发了几种 LNP 修饰和筛选策略并在临床前进行了评估。这些方法包括掺入带电磷脂、LNP 的抗体表面修饰和 DNA 条形码策略。然而，仍需要进一步开发具有生物相容性和可调生物分布特征的平台技术，以释放 RNA 疗法在全身递送方面的全部潜力。

近日， 荷兰埃因霍温理工大学生物学实验室的Roy van der Meel教授 团队 报道了一个基于天然脂蛋白的纳米技术平台，旨在将siRNA、反义寡核苷酸和mRNA 递送到骨髓中的骨髓细胞与造血干细胞。 作者团队创建了一个全面的 aNP 配方库，并广泛表征了它们的物理化学性质和体外性能。从该库中，选择了 8 种具有代表性的 aNP-siRNA 制剂，并评估了它们在静脉内给药后沉默小鼠免疫细胞亚群中溶酶体相关膜蛋白 1 （Lamp1）表达的能力。使用从筛选过程中确定的最有效的 aNP，测试了该平台在同基因小鼠肿瘤模型中治疗性基因沉默的潜力。aNP 平台也被证明适用于与反义寡核苷酸的剪接切换以及骨髓中骨髓祖细胞用信使 RNA 生产蛋白质。aNP 平台具有向骨髓细胞及其祖细胞递送各种类型的核酸治疗药物的转化潜力。

用于 siRNA 递送的 aNP 原型设计：

aNP原型组件包括1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DMPC）、胆固醇、三辛酸甘油酯，由可电离脂质与siRNA构成的核心，以及载脂蛋白A1（apoA1）。 siRNA的回收率、包封率和保留率均高于80% ，这表明siRNA的有效掺入。该aNP原型含有稳定数量的载脂蛋白A1，并且其平均流体动力学直径约为 80 nm， DLS的尺寸分散度为0.1。 冷冻电子显微镜揭示了球形核壳结构。

在利用稳定表达萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的 RAW 264.7小鼠巨噬细胞进行的体外沉默实验中，测定的IC50 值为14.5 nM，这一结果明显优于临床上获批的基于MC3的 LNP 对照制剂的154.3 nM。 随后，开发了一种独特的siRNA放射性标记策略以PET和体外伽马计数定量测定siRNA的生物分布。利用叠氮-炔烃点击化学，将去铁胺B（DFO）功能化到siRNA上，从而使其能够进行锆-89放射性标记。尽管 DLS 显示其流体动力学直径略有增加，但粒子尺寸分布均匀且仍为球形核壳结构。 24小时后，PET成像显示未被负载的89Zr-siRNA经肾脏清除，而与LNP递送相比，aNP递送的89Zr-siRNA在脾脏和骨髓中的积聚明显更强。

图：用于将 siRNA 递送到骨髓细胞区室的 aNP 平台技术原型

aNP 文库筛选：

在对 aNP-siRNA 概念进行原型设计后，设计一个 aNP 优化策略，该策略涉及迭代设计过程，从而产生了一个包含 72 种组成不同的 aNP-siRNA 制剂的库。 在文库中，保持 siRNA 和 apoA1 水平恒定，同时改变胆固醇、三辛酸甘油酯和 MC3 可电离阳离子脂质的量。 MC3复合体使 siRNA 整合到 aNP 的亲脂性核心中，而胆固醇和三辛酸蛋白提供对 aNP 的超分子组织和结构稳定性至关重要的结构特征。两亲性磷脂需要将 siRNA、MC3、三辛酸和胆固醇的亲脂性超分子纳米聚集体分散在水环境中，并与 apoA1 一起稳定 aNP。选择三种已知与 apoA1 相互作用的磷脂，即 DMPC、1-棕榈酰-2-油酰-甘油-3-磷酸胆碱（POPC）和 1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DPPC）。

不同的 aNP 组成和质量特征如图所示，观察到增加三辛酸甘油酯改善了基于 DMPC 的制剂，但没有改善含有 POPC 的 aNP。冷冻电镜揭示了三辛酸甘油酯促进了球形结构的形成。作为一个关键的质量特征，通过对冷冻电镜图像进行半定量评估，在生产后立即测量了 aNP 聚集。发现 55 种配方通过了预定义的阈值 <15%。在体外测量了所有 72 种 aNP 制剂的基因沉默能力。在固定浓度的 100 nM siRNA 下观察到不同的基因敲低能力，范围从无沉默到几乎完全基因沉默。 由于纳米颗粒在体外的沉默能力是静脉给药后体内沉默的不良预测指标，主要使用该沉默指标作为 aNP-siRNA 功能的质量控制。

通过将聚集的质量控制限值设置为 15%，在 28 天时多分散指数（PDI）最大增加 40%，并在体外至少 30% 沉默，确定了 30 种具有潜在有利体内特征的 aNPs。 从这 30 种制剂中，选择了 8 个代表文库多样性的功能性 aNP，用于在随后的小鼠体内基因沉默实验中。纳入了 3 种基于 POPC 的制剂（其中 1种不含三辛酸甘油酯）和 5 种基于 DMPC 的制剂，其中三辛酸甘油酯含量不同。

图：建立和筛选具有不同组成的aNP-siRNA 文库

体内功能筛选 aNPs：

在 aNP 文库表征和体外筛选之后，选择了 8 种具有代表性的 aNP 用于小鼠体内测试。首先使用体外小鼠的骨髓来源的巨噬细胞（BMDM）评估了这八种 aNP-siLAMP1 制剂的敲低功能。 在 100 nM siLAMP1 时，RT-qPCR测量显示，与未处理的细胞相比，所有 8 个 aNP 都显著降低了 LAMP1 表达。 随后将八种不同的 aNP-siLAMP1 制剂以 36 小时的间隔静脉注射给小鼠 4 次，siLAMP1 剂量为 0.5 mg kg ^–1 。在 aNP 选择中，发现免疫细胞中 LAMP1 沉默特征存在很大差异。

临床批准的基于 MC3 的 LNP 制剂在 HSPC 中没有诱导显着（P > 0.9999） LAMP1 敲低，但 观察到使用 aNP8 (P = 0.0107）、aNP18 (P = 0.0117）或 aNP67 (P = 0.0306）时 LAMP1 显着沉默。 虽然 aNP8 (P = 0.0084）和 aNP18 (P = 0.0038）也显着沉默了髓系祖细胞中的 LAMP1，但没有观察到 aNP67在该祖细胞亚群中显着作用 (P = 0.5506）。 根据这些数据，aNP8和 aNP18制剂显示出对干细胞和祖细胞群进行广泛基因沉默的潜力。 同时，aNP67显示对干细胞的沉默偏倚。鉴于 aNP18的广泛沉默特征，选择该配方进行进一步研究。

图：在体内通过基因沉默功能筛选aNP-siRNA

aNP-siRNA 分析和应用：

aNP18是一种基于 DMPC 的配方，不含三辛酸甘油酯。 其 siRNA 回收率、包埋率和保留值超过 80%。 aNP18流体动力学直径约为 50 nm，尺寸分布 PDI < 0.2 和 zeta 电位 -20 mV 。值得注意的是，当储存在4°C的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中时，其siRNA包埋、流体动力学直径和分散性保持稳定八周。冷冻电镜数据显示aNP18-siRNA 主要由多层椭圆形结构组成，这在六个独立生产的批次中是一致的。将89Zr-siRNA整合到aNP18中，并通过离体γ计数评估其在静脉注射后不同时间点的小鼠体内生物分布。 观察到在24小时后，与 LNPs相比，其在骨髓中的积累相当可观，在脾脏中的摄取量也高出约两倍。 由于脾脏也含有髓系细胞和祖细胞，因此该器官的高摄取量是有益的。监测给药后24小时肝脏摄取和肾脏积累略低于LNPs。 肝脏酶和肾脏毒性标志物，在注射磷酸盐缓冲液（PBS）或aNP18-siRNA后，并未观察到显著差异。 此外，TNFα 和 IL-6 的浓度与也无显著差异。

在同种系肿瘤小鼠模型中通过沉默 Ccr2 的表达来评估aNP18的治疗潜力。靶向 Ccr2 mRNA 的 LNP-siRNA 治疗先前已被证明可以减少肿瘤中髓系细胞的流入，从而影响免疫抑制性肿瘤微环境。通过静脉注射将aNP18-siCCR2给予携带MC38肿瘤的C57/BL6小鼠。 与aNP18-siCtrl相比，aNP18-siCCR2治疗可显著诱导骨髓（P=0.005）、脾脏（P=0.0056）和血液（P=0.0007）中Ly6Clow单核细胞中CCR2的敲低。 同时，与之前的研究结果一致，与aNP18-siCtrl相比，aNP18-siCCR2治疗后，肿瘤内驻留的CCR2髓系细胞和巨噬细胞数量显著减少，但肿瘤大小未受影响。由于这些髓系细胞通常具有免疫抑制作用， 其数量减少表明造血器官中单核细胞的流入减少，这表明了aNP平台在免疫治疗方面的潜力。

图：对筛选siRNA-aNP的理化性质、体内行为及治疗应用的深入分析

aNP 在功能上递送ASO 和 mRNA：

除了基因沉默外，还探索了aNP平台递送其他类型核酸治疗药物的能力。 使用含有POPC、胆固醇和ALC-0315的定制制剂，以9的氮磷比（N/P）掺入了一种可诱导剪接转换的反义寡核苷酸（ASO）。 aNP-ASO制剂的平均流体动力学直径约为120 nm，且尺寸分布较窄（PDI < 0.1）。与aNP-siRNA制剂一致，ASO稳定掺入，包封率和回收率均约为80%。为使用NATURA报告基因转染RAW 264.7细胞，当特定ASO成功阻断移码外显子时，其表达的绿色荧光蛋白（GFP）会转变为Turbo RFP。 报告细胞暴露于含有移码靶向ASO的aNP后，观察到了剂量依赖性的剪接转换效果。

为了评估aNP平台封装和 递送mRNA的能力，设计了一种aNP，其含有二甲基磷脂酰胆碱（DMPC）、胆固醇、甘油三酯和ALC-0315，氮磷比（N/P）为6。 冷冻电子显微镜显示，aNP-mRNA具有球形形态，直径约为70 nm。不同批次aNP-mRNA的mRNA包封效率高效（>80%）且稳定。重要的是，当aNP制剂在4°C的 PBS 中储存时，其mRNA包封率、流体动力学直径和分散度在八周内保持稳定。aNP-mRNA的 Zeta 电位约为-17 mV，与aNP18-siRNA相当。 用含有编码 GFP 的mRNA的aNP处理RAW 264.7细胞。流式细胞术分析显示，转染效率高且具有剂量依赖性。 最后，通过静脉注射含有编码mCherry的mRNA的aNP和 LNP，在体内评估了aNP-mRNA的功能效应。对骨髓髓系祖细胞的流式细胞术分析显示，与LNP-mRNA相比，aNP-mRNA治疗后mCherry阳性细胞数量显著增加（P = 0.0241），且表达水平更高（P = 0.0407）。

图：用于 ASO 和 mRNA 递送至免疫细胞的 aNP 制剂

小结：

Nature Nanotechnology：靶向骨髓细胞区室的天然脂质载体！

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