聚己内酯（PCL）是应用最广泛的3D打印材料之一，但其疏水特性不利于细胞粘附和增殖。研究表明，聚多巴胺（PDA）能促进BMSCs在聚合物表面增殖并诱导其成骨细胞分化。然而，不同厚度的 PDA 涂层对BMSCs成骨分化的影响却鲜有报道。
广东省科学院生物与医学工程研究所许为康
团队和
遵义医科大学附属第二医院瓦庆德
团队
利用3D打印技术制备了PCL支架。通过控制多巴胺水溶液的浸泡时间，在支架表面形成不同浓度的PDA涂层，整个复合支架的制备过程简单快捷
。研究不同厚度的 PDA 涂层支架在调节巨噬细胞极化、促进细胞增殖粘附变化、骨诱导和颅骨缺损修复方面的性能。
1、主要内容
图1 四组支架的材料特征和理化特性
表 1 PDA改性前后支架的元素组成分析
与PCL组相比，PDA-PCL-3、PDA-PCL-6、PDA-PCL-24三组支架表面有白色颗粒分布，
这是由于DA在PCL表面发生氧化聚合反应形成PDA涂层附着所致，随着浸泡的时间延长，支架表面涂层越明显。
PCL支架未检测出氮原子，而浸泡DA溶液后支架氮原子的组成变为PDA-PCL-3 5.99%、PDA-PCL-6 6.82%、PDA-PCL-24 9.65%，PDA中的乙胺基提供了这些原子。除PDA-PCL-24组拥有的32.11%O且比PCL的30.57%上升以外，其余含PDA支架的C、O元素均较PCL组有所下降，这是可能是元素组成中PCL基底仍占据主导位置以及能谱扫面深度有限所致。
在PDA-PCL-3、PDA-PCL-6、PDA-PCL-24三组中，随着浸泡时间不同，C元素含量逐步下降，而O元素则相反，这也与DA氧化聚合的时间预期相符
。
涂层支架均出现PDA特征性活性基团，3000-3500cm
-1
处代表O-H和N-H的伸缩振动。PDA特征峰总体上随浸泡时间越长越明显。四组支架的抗压强度大约为8MPa，孔隙率均大约75%，组间无显著差异。
这表明PDA涂层未改变PCL支架原有的机械性能和孔隙率。
图2支架促BMSCs粘附与增殖
细胞在支架上的增殖黏附程度对骨修复有着重要作用。在支架与BMSCs共培养后的第1、3和7d采用CCK8法评估其增殖活性。在第1和3天，具备PDA涂层的支架上细胞增殖活性显著优于PCL组。在第7天，PDA-PCL-6组支架表现出比PCL组更显著的促BMSCs增殖活性，其余各组间无显著差异。支架表面可见大量柱状、片状形态的BMSCs附着，见细胞伪足，与细胞增殖结果相似。
PDA涂层可促进细胞粘附，PDA-PCL-6组粘附最显著，PDA-PCL-3、PDA-PCL-24组则无显著差异
。
PCL虽因其疏水特性不利于细胞粘附，由于其支架表面具有一定的粗糙度，促使部分细胞附着。
图3 支架的体外促BMSCs成骨分化性能
钙结节的染色和定量分析显示PDA-PCL-6组钙结节含量最显著，而PDA-PCL-3和PDA-PCL-24组无显著差异，与ALP的趋势基本一致。在成骨相关基因（RunX2、ALP、Col-I）表达方面，总体上，附着PDA涂层更利于RunX2表达，PDA-PCL-6与PDA-PCL-24组表达相近，显著高于PDA-PCL-3组。各组支架的ALP基因表达与ALP定量结果类似，PDA-PCL-6组表达量显著上升，但PDA-PCL-24组与其他组无显著差异。在Col-I表达中，PDA-PCL-6组表达量仍最为显著，PDA-PCL-3组优于PDA-PCL-0组，PDA-PCL-24与上述两组无显著差异。
总体上PDA涂层显示出优异的促BMSCs成骨分化性能，以PDA-PCL-6组最显著。适当的PDA厚度可能会实现优越的细胞粘附和骨增强特性，因为过高的DA浓度可能会抑制骨髓间充质干细胞的生长。研究发现，DA浓度的逐渐增加（0.5 nM-10 nM）有利于成骨分化，但DA刺激的成骨性能从10 nM-50 nM逐渐下降，而DA介导的骨活性在50 nM时仍显著高于5 nM。我们的PDA-PCL-6释放的DA浓度范围为33-44nM，显示出最优异的骨诱导性能。
图4 支架调控RAW264.7细胞中巨噬细胞M1表型基因IL1β和M2表型基因CD206的表达
在促进巨噬细胞极化方面，pda包被的支架显著上调了CD206的表达，并显著抑制了IL1β的表达，其中，PDA-PCL-6在促进巨噬细胞从M1向M2表型转变方面表现最为显著。这是由于PDA具有清除氧化自由基的特性，下调炎症细胞因子的表达，并刺激巨噬细胞M2表型。
图5 大鼠颅骨缺损模型的骨再生micro-CT结果
空白组（未接受支架植入物）在术后 4 周和 8 周时，缺损区域内的新骨形成极少。即使到了 12 周，新骨组织也没有明显增加，这表明在没有支架的情况下，骨修复过程并不理想。相比之下，PCL 组在术后 4 周显示出一些新骨形成，但随后 8 周和 12 周新骨组织的增加不足以完全愈合剩余的大量骨缺损。这一观察结果凸显了
纯PCL支架在骨修复方面的成骨潜力有限
。与 PCL 组相比，PDA/PCL 组在每个时间点上的新骨形成都更胜一筹。4 周时，缺损区内的骨小梁沿着复合支架明显生长，8 周时，这种生长逐渐增加。到 12 周时，缺损区几乎被骨小梁和片状骨填满，表明骨修复过程更加有效。对术后 4、8 和 12 周缺损区骨体积分数的定量分析证实了 PDA/PCL 复合支架相比之下，空白组的结果最差，差异有统计学意义，这说明
PDA 改性支架在促进骨再生方面具有更强的骨诱导特性
。
图6 术后第4、8和12周各组大鼠骨缺损标本的HE染色
图7 术后第4、8和12周各组大鼠骨缺损标本的Masson染色
图8 术后第4、8和12周各组大鼠骨缺损标本的Movat染色
为了进一步验证PDA涂层支架的体内骨缺损修复效果，我们分别在术后第4周、8周和12周采集了大鼠颅骨标本，并通过H&E、Masson和Movat染色分析了缺损部位的骨形成情况。从第4周时的H&E染色图像可以清楚地观察到，空白组在骨缺损区域有大量纤维组织，新的骨组织较少。PCL组在缺损区域显示出少量新骨，而PDA-PCL组则显示出大量新骨。第8周时，与其余两组相比，PDA-PCL 组的新骨组织分布更广。新骨组织逐渐在相互连接的孔隙中形成，在材料-骨界面和多孔材料内部观察到大量的类骨组织和少量的编织骨。到第12周时，随着PCL的逐渐降解和缺损面积的进一步缩小，PDA-PCL组的新生骨形成了连续的块状，与空白组和PCL组相比，新生骨的面积明显增大。
Masson染色第4周时，相比PCL组，PDA-PCL组有较多的淡蓝色胶原组织和红色的肌纤维组织，最少的是空白组。随着时间的推演，第8和12周时各组的新生骨组织进一步成熟，均出现深蓝色的成熟骨胶原，以PDA-PCL组最显著，PCL组次之。
Movat染色的结果与上述染色的结果梯度一致。Movat染色中黄色表示胶原蛋白和网状纤维，蓝绿色为蛋白聚糖，深红色为类纤维素或纤维素。由图Fig 8可看出，新生骨组织逐步取代支架，PDA-PCL组出现大量的黄染胶原纤维和网状纤维，形成更多的新生骨组织且出现皮质桥接。而空白组被大量的肌肉组织占据，新生骨组织较少，皮质桥接不明显。PCL出现了新骨沉积，骨形成介于其余两组之间。
这些结果表明，
PDA功能化的PCL之间在不添加外源性种子细胞或生长因子的情况下，可以很好的诱导原位骨再生。
图 9 术后第4、8和12周各组大鼠骨缺损标本中BMP-2的表达情况
图10 术后第4、8和12周各组大鼠骨缺损标本中Col-I的表达情况
为了进一步评估支架的成骨能力，我们对各组支架进行了免疫组化染色，以检测BMP-2和Col-I。如图9和图10所示，第4周时，PDA-PCL组骨缺损区新形成的组织周围有明显的棕黄色区域，表明BMP-2和Col-I有阳性表达区域。PCL组有一些阳性表达区，而黑色组几乎没有阳性表达。第8周时，PDA-PCL组和PCL组都显示出不连续的新骨形成，PDA-PCL组在新骨基质周围显示出更深的棕黄色BMP-2和Col-I阳性表达区，而黑色组仅显示出少量BMP-2和Col-I表达。到第12周时，各组骨缺损部位的BMP-2和Col-I表达均比早期时间点有所增加，其中PDA-PCL组的阳性表达明显高于PCL组和空白组。这表明，
PDA 功能化涂层显著提高了PCL支架的骨诱导效率，促进了骨组织标志物的表达。
表2 各组大鼠在术后第4、8和12周的血液指标
图11 术后第4、8和12周各组大鼠肝脏的HE染色
图12 术后第4、8和12周各组大鼠肾脏的HE染色
三组大鼠在术后第4周、第8周和第12周的血常规指标见表2，白细胞计数（WBC）、红细胞计数（RBC）、血红蛋白（HB）、血小板（PLT）、谷氨酸氨基转移酶（ALT）、谷氨酸氨基转移酶（AST）、肌酐（Cr）和尿素（Urea）在空白组组、PCL 组和 PDA-PCL 组之间差异无统计学意义。材料组大鼠的主要内脏（心、肝、脾、肺和肾脏）与对照组无显著差异。
结果证明PDA涂层支架具备良好的体内生物相容性。
2、
总结与展望
这项研究成功地开发出了具有高生物活性PDA涂层的3D打印PCL支架。
与纯PCL支架相比，PDA涂层支架，尤其是PDA-PCL-6组，具有免疫调节特性，能显著促进BMSCs的增殖、粘附和成骨分化。
此外，
PDA涂层支架对大鼠颅骨缺损的修复有积极作用，并具有良好的组织相容性，为骨缺损的治疗提供了一种很有前景的新方法
。
然而，这些支架在修复较大或广泛骨缺损方面的疗效值得进一步深入研究。
参考资料
：
https://doi.org/10.36922/ijb.4995
来源：EngineeringForLife
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