主要观点总结
这篇文章主要介绍了泛素-蛋白酶体蛋白降解途径,包括泛素化过程、非典型泛素化的调控机制及生理功能,以及Nrf1的泛素化调控对细胞蛋白质代谢的影响。文章详细阐述了泛素化的过程,包括E1、E2、E3酶的作用,泛素链的形成以及泛素化对蛋白质降解的影响。同时,也介绍了非典型泛素化的研究,包括Nrf1的活化受非传统泛素化途径的调控,以及SCF FBS2复合物如何通过识别Nrf1上的N-糖基进行泛素化,影响Nrf1的活性等。此外,文章还讨论了这一研究领域的一些最新进展和研究成果。
关键观点总结
关键观点1: 泛素-蛋白酶体蛋白降解途径是细胞内重要的蛋白质降解机制。
目标蛋白通过E1、E2、E3酶进行泛素化,随后被26S蛋白酶体降解。泛素化通常涉及泛素分子和靶蛋白赖氨酸(K)侧链的ε-氨基基团之间形成异肽键。除了常规泛素化,泛素链还可以连接在蛋白质中的丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和半胱氨酸(C)残基上。
关键观点2: 非典型泛素化的调控机制及生理功能目前仍未完全厘清。
最近的研究表明,Nrf1的活化受一种由糖修饰介导的非传统泛素化途径的调控。这种途径通过识别Nrf1上的N-糖基,形成复杂的泛素链,抑制了Nrf1的激活。
关键观点3: Nrf1的泛素化调控对细胞蛋白质代谢具有重要影响。
Nrf1是新合成的蛋白质降解途径的关键转录因子。在非应激条件下,Nrf1被持续泛素化并逆转移到细胞质中降解。然而,当蛋白酶体活性受损时,Nrf1无法被降解并被转运到细胞核,诱导编码蛋白酶体亚基的基因表达,以恢复蛋白酶体的活性。
正文
泛素-蛋白酶体蛋白降解途径是细胞内一种重要的蛋白质降解机制,目标蛋白首先通过E1(泛素活化酶)活化泛素,泛素活化后结合到E2(泛素结合酶)并被转移到E3(泛素连接酶)以识别特定的目标蛋白,随后被26S蛋白酶体降解【1】。泛素化通常涉及泛素分子和靶蛋白赖氨酸(K)侧链的ε-氨基基团之间形成异肽键,而除了常规泛素化外,泛素链还可以连接在蛋白质中的丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和半胱氨酸(C)残基上【2】。此外,也有报道显示泛素化也会发生在非蛋白质底物上,包括脂多糖、ADP-核糖、糖原和磷脂酰乙醇胺等【3,4】。然而,非典型泛素化的调控机制及生理功能目前仍未完全厘清。在真核生物中,蛋白酶体基因的表达由核因子红细胞2样1蛋白(NFE2L1,也称为Nrf1)诱导【5】。新合成的Nrf1靶向内质网,并发生高度的N-糖基化。在非应激条件下,Nrf1被HRD1持续泛素化并逆转移到细胞质,由肽:N-糖苷酶NGLY1去糖基化,发生蛋白酶体降解。然而,当蛋白酶体活性受损时,Nrf1无法被降解并被转运到细胞核,而在细胞质酶DDI2和NGLY1的调控下,诱导编码蛋白酶体亚基的基因表达,以恢复蛋白酶体的活性,这个反应通常称为反弹反应(bounce-back response)【5】。其中,DDI2蛋白水解并切割Nrf1,移除N端约100个氨基酸;而NGLY1则从靶蛋白中去除N-糖基,导致糖基化天冬酰胺(N)残基转变为天冬氨酸(D),以上两种Nrf1的序列变化对其激活至关重要。最近的研究分析了NGLY1缺失细胞和小鼠中SCF E3泛素连接酶复合物(尤其是FBS2蛋白)对Nrf1的泛素化作用【6】,发现FBS2能识别并结合N-高甘露糖糖蛋白,导致NGLY1缺失的细胞生长停滞和死亡。额外敲除内-β-乙酰氨基葡萄糖苷酶(ENGASE)编码基因可以部分恢复NGLY1缺失小鼠的存活率,表明ENGASE和FBS2是NGLY1缺陷的遗传修饰因子。尽管Nrf1在这些细胞和小鼠中被高度泛素化,但这些泛素化的Nrf1不会被蛋白酶体降解或被DDI2切割,表明SCFFBS2介导的泛素化与传统的HRD1介导的泛素化不同。近日,日本理化学研究所(RIKEN)Tadashi Suzuki实验室领衔在Molecular Cell杂志发表了题为Sugar-mediated non-canonical ubiquitination impairs Nrf1/NFE2L1 activation的研究文章,发现Nrf1/NFE2L1的活化受一种由糖修饰介导的非传统泛素化途径的调控。这一非传统泛素化途径通过ENGASE酶去除N-糖基,使Nrf1成为SCFFBS2/FBXO6识别的靶点,并通过形成泛素链抑制了Nrf1的激活。SKP1-CUL1-F-box (SCF)FBS2/FBXO6是一种识别 N-糖的 E3 泛素连接酶,能够通过识别N-糖基而泛素化Nrf1,然而Nrf1的N-糖基化位点簇周围并没有典型的易发生泛素化的赖氨酸(K)残基,因此作者首先探究了Nrf1在非典型位点发生泛素化的可能性和机制。作者构建了所有K残基被替换为精氨酸(R)的Nrf1突变体(26KR),并在HeLa细胞中与FBS2共同过表达。实验结果表明,即使没有K残基,Nrf1仍被泛素化,且通过NaOH或羟胺处理后这些泛素链被消除,表明它们是通过氧酯键连接在了丝氨酸(S)和苏氨酸(T)残基上。此外,FBS2在Nrf1的N-糖基簇区域识别并进行非K位点泛素化。这种非典型的泛素化方式在NGLY1缺失的细胞中尤为显著,表明在缺乏NGLY1的情况下,Nrf1仍能通过补偿性泛素化逆向转运和被DDI2处理,并最终转运到细胞核。因此, SCFFBS2能够识别Nrf1核心区域的N-糖基簇,并通过氧酯键对非K位点进行非典型泛素化。进一步研究发现,在NGLY1缺失细胞中,FBS2可以更有效地对Nrf1进行泛素化。而ENGASE的存在则进一步增强了这种泛素化效果,尤其是在NGLY1和ENGASE双敲除的细胞中,FBS2对Nrf1的泛素化完全依赖ENGASE的活性。SCFFBS2通过识别Nrf1上的N-糖基进行泛素化,这种泛素化阻止了Nrf1的DDI2处理和细胞核转运,从而防止了Nrf1上调蛋白酶体基因表达。因此,ENGASE和FBS2共同作用,通过泛素化途径调控Nrf1的活性,甚至影响了细胞对蛋白酶体抑制剂的敏感性。ENGASE作用于N-糖基中最内层的N,N’-二乙酰几丁二糖部分的糖苷键,生成N-GlcNAc修饰的糖蛋白。由于在不能生成N-GlcNAc残基的NGLY1:ENGASE-dKO和ENGASE-KO细胞中,FBS2介导的Nrf1泛素化几乎不会发生,因此作者推测SCFFBS2可能会泛素化Nrf1上的N-GlcNAc残基。利用化学合成的糖肽和重组蛋白进行了体外泛素化实验后,作者发现SCFFBS2在与ARIH1协同的情况下,可以通过N-GlcNAc和T残基对Nrf1进行泛素化修饰,泛素链通过氧酯键连接,且泛素化主要发生在N-GlcNAc的6位羟基上。SCFFBS2-ARIH1-UBE2L3对Nrf1的非典型泛素化修饰可能是由于Nrf1的N-糖基化位点附近缺乏赖氨酸(K)残基。为了检查SCFFBS2的经典泛素化,作者合成了GP8,通过用K替代GP1中的N-GlcNAc,发现K连接的泛素化比通过氧酯键实现的泛素化效率显著提高。此外,SCFFBS2主要通过K48连接泛素链,同时也形成了非典型的K6、K33、K11和K29连接链。可见,ARIH1和SCFFBS2对Nrf1的泛素化至关重要,尤其是在非典型泛素链的形成中。此外,利用泛素突变体进行检测后发现,K6、K11、K33和K48残基对于泛素链的复杂组装是必需的。这些结果共同表明,ARIH1和UBE2L3在Nrf1泛素化过程中发挥了关键作用。接下来作者探究了SCFFBS2依赖性Nrf1泛素化对其蛋白降解的影响。cycloheximide(CHX)和VCP抑制剂NMS-873处理细胞后,作者发现Nrf1在NGLY1-KO细胞中的降解显著延迟,而在WT和NGLY1:ENGASE-dKO细胞中则无显著变化。在NGLY1-KO细胞中,即使在Bortezomib(Btz)处理后,泛素化的Nrf1仍然稳定存在于细胞质中,而非聚集体中。进一步分析发现,尽管大部分泛素化蛋白质在DUBs(去泛素化酶)作用下被去泛素化,泛素化Nrf1上的较短链泛素链对DUBs仍具有一定的抗性。在E1抑制剂MLN7243处理的细胞中,总泛素化蛋白质的丰度显著减少,而Nrf1上的较短泛素链则对去泛素化完全不敏感。最后,通过免疫共沉淀实验发现,部分泛素化的Nrf1仍与SCFFBS2-ARIH1复合物结合,这可能影响了DUBs对泛素链的可及性。这些结果表明,SCFFBS2-ARIH1泛素化修饰的Nrf1在细胞质中保持稳定,且对去泛素化调节并不敏感。综上所述,本研究揭示了非传统泛素化在调控细胞内蛋白质代谢中的重要角色。通过识别Nrf1上的N-糖基并形成复杂的泛素链,SCFFBS2-ARIH1-UBE2L3复合物能够抑制Nrf1的活化,这一发现拓展了我们对非典型泛素化过程的理解,也为解析NGLY1缺陷症等蛋白质代谢障碍性疾病的发病机制提供了新的思路。https://doi.org/10.1016/j.molcel.2024.07.013制版人:十一
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