贵州大学何腾霞团队Bioresource Technol.：铜离子对耐冷假单胞菌NY 1异养硝化与反硝化的增强作用及机理

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成果简介

近日，贵州大学生命科学学院何腾霞教授团队在环境领域著名学术期刊 Bioresource Technology 上发表了题为 “Enhancement of cold-adapted heterotrophic nitrification and denitrification in Pseudomonas sp. NY1 by cupric ions: Performance and mechanism” 的研究论文 。文中分离、筛选并鉴定出一株耐冷高效异养硝化 - 好氧反硝化菌株 NY1 ，同时，低浓度 Cu ²⁺ 显著促进了该菌对铵盐和亚硝酸盐的去除速率 。进一步研究发现，低浓度的 Cu ²⁺ 还 促进了菌株 NY1 脱氮过程中的电子传递系统活性和关键酶比活力。该研究有助于深化有关 Cu ²⁺ 在低温条件下对微生物脱氮能力的影响及其作用机制的理解，并为含 Cu ²⁺ 的低温废水的生物脱氮处理提供一定的数据支持和理论参考 。

引言

目标菌株在 15 ℃ 下培养后，在 BTB 固体培养基上呈圆形、不透明、边缘不规则、凸起、乳白色并具有光滑湿润的表面。扫描电镜图像显示该菌呈杆状，且该菌革兰氏染色结果为阴性。将目的菌株的 16S rRNA 基因序列提交至 NCBI 数据库，序列通过 BLAST 比对及 MEGA 5.0 构建系统发育树，结果表明目标菌株与荧光假单胞菌（ Pseudomonas fluorescens ） HK44T 亲缘性最高（ 93% ）。综合以上鉴定结果，目标菌株为假单胞菌（ Pseudomona sp. ），并命名为 NY1 。

不同浓度 Cu ²⁺ 对菌株 NY1 硝化过程的影响

图 2 ：不同浓度 Cu ²⁺ 对菌株 NY1 硝化过程的影响（以 NH ₄ ⁺ -N 为氮源）

（ A ） Cu ²⁺ 对 NH ₄ ⁺ -N 去除的影响，（ B ） Cu ²⁺ 对 TN 去除的影响，（ C ） Cu ²⁺ 对 NH ₄ ⁺ -N 去除过程的中间产物及细胞生长的影响

通过在培养基中添加 0 、 0.05 、 0.1 、 0.5 、 1.0 、 2.0 和 4.0 mg/L 的 Cu ²⁺ ，明确了不同浓度 Cu ²⁺ 对菌株 NY1 硝化过程的影响。结果显示，菌株 NY1 在 15 ℃ 条件下可将约 50 mg/L 的 NH ₄ ⁺ -N 去除 99.18% 。 0.05-0.5 mg/L 的 Cu ²⁺ 作用下使 NH ₄ ⁺ -N 的转化效率比对照组提高了 2.33%-4.85% ，表明低浓度 Cu ²⁺ 可促进菌株 NY1 硝化过程的进行。最大去除速率从 9.48 mg/L/h 提高至 10.26 mg/L/h 。然而，随着 Cu ²⁺ 浓度（ ≥1.0 mg/L ）的逐渐提高，菌株 NY1 去除 NH ₄ ⁺ -N 的能力逐渐被抑制，且浓度越高，抑制作用越强，直至 Cu ²⁺ 浓度为 4.0 mg/L 时，其生长繁殖和氮代谢能力完全丧失。 推测其原因是 Cu ²⁺ 和一些含 Cu ²⁺ 的化合物会螯合氢磺酰基，进而破坏酶和蛋白质，使微生物的脱氮能力受到抑制或丧失。当 Cu ²⁺ 浓度为 2.0 mg/L 时，菌株 NY1 仍能去除 45.26% 的 NH ₄ ⁺ -N ，表明该菌对高浓度的 Cu ²⁺ 具有一定的耐受能力 。

不同浓度 Cu ²⁺ 对菌株 NY1 反硝化过程的影响

图 3 ：不同浓度 Cu ²⁺ 对菌株 NY1 反硝化过程的影响（以 NO ₃ ^- -N 为 氮源）

（ A ） Cu ²⁺ 对 NO ₃ ^- -N 去除的影响，（ B ） Cu ²⁺ 对 TN 去除的影响，（ C ） Cu ²⁺ 对 NO ₃ ^- -N 去除过程的中间产物及细胞生长的影响

图 4 ：不同浓度 Cu ²⁺ 对菌株 NY1 反硝化过程的影响（以 NO ₂ ^- -N 为 氮源）

（ A ） Cu ²⁺ 对 NO ₂ ^- -N 去除的影响，（ B ） Cu ²⁺ 对 TN 去除的影响，（ C ） Cu ²⁺ 对 NO ₂ ^- -N 去除过程的中间产物及细胞生长的影响

在反硝化过程中，菌株 NY1 在 15 ℃ 、 15 h 内可 高效降解 NO ₃ ^- -N （ 98.17% ）和 NO ₂ ^- -N （ 100% ），最大去除速率分别高达 8.56 mg/L/h 和 6.80 mg/L/h 。当 Cu ²⁺ 浓度小于 0.5 mg/L 时，可促进菌株 NY1 的生长繁殖并加速该菌去除 NO ₂ ^- -N 过程，但对 NO ₃ -N 去除过程无显著促进作用。 尤其在 0.05mg/L 的 Cu ²⁺ 作用下，使 NO ₂ ^- -N 的去除效率提高了 12.30% ，最大去除速率从 6.20 mg/L/h 提高 6.80 mg/L/h 。低浓度 Cu ²⁺ 作用下菌株 NY1 快速去除 NO ₂ ^- -N 的原因可能是 Cu ²⁺ 对含铜亚硝酸盐还原酶 NirK 的表达调控的结果所致。高浓度（ 2.0 mg/L ）的 Cu ²⁺ 作用下，菌株 NY1 去除 NO ₂ ^- -N 的能力才被完全抑制，且仍能去除 8.45% 的 NO ₃ ^- -N ，也表明该菌反硝化过程对高浓度 Cu ²⁺ 具有一定耐受性 。

Cu ²⁺ 对菌株 NY1 脱氮过程中电子传递系统活性及脱氮关键酶比活力的影响

表 1 Cu ²⁺ 对脱氮过程中电子传递系统活性的影响

表 2 Cu ²⁺ 对菌株 NY1 脱氮过程关键酶比活力的影响

注： 0 mg/L 、 0.05 mg/L 、 2.0 mg/L 及 4.0 mg/L 均表示相应 Cu ²⁺ 浓度；数值均为平均值 ± 标准差；（ — ）表示未测定该 Cu ²⁺ 浓度下的电子传系统活性及酶比活力值。

研究表明 Cu ²⁺ 胁迫下不仅会影响菌株 NY1 脱氮的速率及效率，还会显著影响该菌脱氮过程中的电子传递系统活性和关键酶比活力。在 0.05 mg/L 的 Cu ²⁺ 作用下， NH ₄ ⁺ -N 去除过程的电子传递系统活性被略微提高，但显著提高了 NO ₂ ^- -N 去除过程的电子传递系统活性。高浓度 Cu ²⁺ 存在时则显著抑制 NO ₂ ^- -N 、 NO ₃ ^- -N 和 NH ₄ ⁺ -N 去除过程的电子传递系统活性。 Cu ²⁺ 显著影响菌株 NY1 脱氮关键酶氨单加氧酶（ AMO ）、硝酸盐还原酶（ NR ）及亚硝酸盐还原酶（ NIR ）的比活力。低浓度 Cu ²⁺ 作用下可显著增强 NIR 的比活力，还可略微提高 AMO 的比活力大小。同时，高浓度 Cu ²⁺ 作用下 , AMO 、 NIR 及 NAR 比活力均显著下降，使菌株 NY1 去除无机氮的能力降低甚至丧失。表明 Cu ²⁺ 作用对菌株 NY1 高效脱氮过程的影响可通过改变氮代谢过程的电子传递系统活性及关键酶比活力来实现。 Cu ²⁺ 对 NY 1 菌株比酶活力的影响可能是由以下几个关键因素引起的。 (a) Cu ²⁺ 直接与酶分子结合，改变酶构象并影响活性位点的功能性，从而影响酶的催化效率 ; （ B ） Cu ²⁺ 还可以调节基因表达，影响酶的合成，从而改变它们的细胞内浓度和比活性 ; （ c ） Cu ²⁺ 的存在可影响细胞内环境条件（例如 pH 和氧化还原电位），从而影响酶的稳定性和活性。