水凝胶，最新Nature Nanotechnology！

类器官技术

类器官（Organoid）已成为基础研究、人类疾病建模和个性化医疗中广泛使用的工具，并已被用于各种组织。虽然包括视网膜类器官（RO）在内的类器官与体内同类具有许多相同的特性，但端点形态、细胞类型多样性和功能已被证明难以复制。成形素梯度（morphogen gradient）缺乏空间组织是限制类器官完全模拟相应器官并使其无法成为更具生理相关性的模型系统的重要因素之一。利用工程材料时空传递生物活性线索，最终指导类器官发育，可能是解决这些局限性的一条有前景的途径。

到目前为止，成形素梯度主要通过微流体装置、用生化铜对水凝胶进行图案化以及在类器官的极部整合转基因细胞信号中心在干细胞培养中实现。然而，这些方法只能提供从各个类器官的外部到内部的形态发生素梯度的单向斜率，使类器官的外细胞层不断暴露于比内细胞层更高浓度的成形素。为了创建空间离散的类器官内部形态发生源，从而产生反向梯度，之前已经探索了微/纳米颗粒在早期球体组装过程中的共聚集作用。利用干细胞聚集体融合技术，人们实现了对融合聚集体中微粒介导的成形素释放的广泛空间控制。然而，这种技术既不能给用户直接和精确的空间控制，也不能给用户时间控制；它针对早期类器官组装进行了优化，在中后期类器官培养中的适用性有限。因此，需要更好地控制成形素梯度的开始，并需要新的、广泛适用的成形素递送技术。

时空控制形态素释放

在这项研究中，海德堡大学Kerstin Göpfrich和Joachim Wittbrodt等人介绍了具有组织模拟可调刚度的纳米工程化DNA微珠，用于在类器官发育的任何阶段在类器官内实现时空控制的成形素梯度。通过使用斑蝥视网膜类器官和早期胚胎，研究发现DNA微珠可以通过显微注射整合到胚胎和类器官中，并以非侵入性的方式用光擦除。将重组替代物Wnt与DNA微珠结合，作者证明了微注射部位时空控制的成形素释放，从而形成成形素梯度，导致视网膜色素上皮的形成，同时保持神经视网膜细胞类型。因此，作者对视网膜类器官进行了生物工程改造，以更紧密地反映体内视网膜的细胞类型多样性。由于简单的一锅法制造工艺，DNA微珠技术可以适用于其他类器官系统，以改善组织模拟。相关工作以“DNA microbeads for spatio-temporally controlled morphogen release within organoids”为题发表在Nature Nanotechnology。

【文章要点】

一、DNA微珠的可定制材料特性

DNA水凝胶材料因其可通过序列特异性进行简单编程而广受欢迎。通过这种方式，已经创建了具有可控刚度和化学修饰的多功能DNA基材料。这种液滴已被用作吸收和输送分子货物的工具，甚至在生命系统中也是如此。然而，除了形成基于DNA的水凝胶作为细胞外基质模拟物外，DNA水凝胶作为类器官工程工具的潜力在很大程度上仍未得到探索。在这篇文章中，为了建立一种能够从类器官内提供化学线索的通用工具，作者着手设计DNA微珠，以满足几个关键要求：（i）可扩展性（DNA微珠的生产应该是简单和可扩展的，不需要使用专门的设备或专家知识，这样就可以在任何实验室进行），（ii）可调力学（DNA微球的机械性能必须可调，以模拟不同范围的细胞硬度或提供机械线索），（iii）微注射兼容（DNA微珠必须高度抵抗剪切应力，以允许微注射到类器官中），（iv）生物相容性（微珠应在类器官内部稳定，并可在一旦达到目的，就要避免对类器官发育产生不利影响）和（v）化学可改性（必须能够将多种化学线索附着在微珠上，并在类器官内部时空控制下按需释放）（图1）。因此，作者采用了一种由三条单链组成的DNA设计，这些单链结合形成具有三个臂的分支双链DNA纳米结构，称为Y-motif。当这些DNA纳米结构通过Y基序臂两端的短粘性端部悬垂物相互连接时，就可以形成DNA水凝胶。作者意识到，将DNA链包封到油包水珠中，可以形成微米级DNA水凝胶珠的液滴模板。简而言之，在反应管中，将含有两个正交Y基序和DNA接头的水溶液分层在油-表面活性剂溶液的顶部。通过手动摇动反应管产生液滴乳液。DNA通过自组装凝聚成微珠。在最后一步中，乳液被破碎，即用型DNA微珠被释放到水相中。这种简单的形成在一锅反应中稳定地生产出大量的DNA微珠，无需专门的设备。

图1 DNA微珠的产生和对RO细胞的刚度适应

二、DNA微珠的类器官递送以及可控成形素梯度的形成

DNA微珠在显微注射过程中能够承受强大的剪切力而不会分解，即使在不断变化的培养基和条件下也会留在类器官系统中。在确认DNA微珠在RO内是稳定的，不会阻碍其发育后，作者接下来将功能纳入DNA微珠中，作为控制其在类器官内行为的一种手段。在DNA连接体的中心添加一个光可裂解（PC）片段，可以在用405nm光照射时，在时空控制下使DNA微珠几乎瞬间分解（PC修饰的DNA微珠）。作者证实，PC修饰的DNA微珠的光触发分解不仅可能在本体溶液中发生，也可能在微量注射的RO中发生。因此，在DNA微珠上使用PC修饰可以在组织整合后无创地去除它们，并完全由用户控制（图2）。接下来，研究展示了DNA微珠系统在成形素靶向释放后在类器官内形成化学线索梯度的实用性。Wnt激动药经常用于RO细胞培养，因为它们可以诱导视网膜色素上皮（RPE）的形成。除了RO，Wnt在跨类型和物种的器官和类器官发育中起着重要作用，并广泛应用于几种类器官细胞培养。在此，作者使用了一种细胞外结合的下一代替代物Wnt（Wnt-surrogate），作者使用生物正交DBCO叠氮化物点击化学通过PC基团将其共价连接到DNA接头上，从而可将Wnt替代物掺入DNA微珠中。

图2 DNA微珠可以使用光从RO中非侵入性地去除，同时也允许Wnt替代物以从内到外的梯度局部释放

三、更类活体的类器官

研究显示，将Wnt替代物DNA微珠修饰与活体RO中的微量注射相结合，在紫外光照射下，Wnt替代品从DNA微珠中释放出来，而不会导致DNA微珠破裂。实验和理论研究表明，Wnt替代物和DNA-Y-motif梯度的两种情况分别对应于释放受限和扩散受限扩散的两种不同状态。这些结果共同证实，DNA微珠技术可以物理控制的方式建立梯度。最后，作者展示了DNA微珠系统的实用性，通过从类器官内部向外部梯度靶向释放成形素来指导类器官发育。目前，在培养基中补充Wnt激动剂按需诱导RO中的RPE会导致神经视网膜组织的不必要抑制，因此无法在跨物种的RO细胞培养中完全模拟体内视网膜细胞类型的多样性。通过将Wnt DNA微珠微量注射到RO中并随后释放Wnt替代物，作者可诱导RPE形成，同时不抑制视网膜神经节细胞。作者认为，这是因为类器官内部Wnt替代物梯度限制了位于RO边缘附近的神经视网膜细胞的暴露，这与将Wnt激动剂添加到培养基中从而最大程度地暴露外细胞的标准方法不同。因此， DNA微珠技术能够使RO的生物工程具有更接近体内视网膜的细胞类型组成。此外，RPE直接在DNA微珠的位置周围形成，证实了所提出技术的空间控制能力（图3）。

图3 Wnt替代物在类器官内部梯度中的控制释放允许RO的生物工程化展现更多的类体内视网膜细胞类型多样性

【结论与展望】

这项工作表明，细胞大小、刚度适应性强的DNA微珠可以通过显微注射整合到类器官中，并且它们的货物可以被光非侵入性地释放。该技术允许用户在类器官的生物工程中进行空间和时间控制，在整个发育过程中使用内部提供的成形素。虽然这项工作首次使用蛋白质证明了这一机制的原理应用，但根据同样的原理，将任何点击化学可寻址分子递送到组织中都是可行的。所提出的技术有望解决将成形素源实施到任何发育阶段的3D类器官细胞培养中的需求。

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