Sci. Adv. | 开发对突触释放锌离子进行成像的基因编码荧光指示剂

王初课题组 · 公众号 · · 2023-03-08 08:59

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大家好，今天分享一篇发表在 science advances 的文章： A genetically encoded far-red fluorescent indicator for imaging synaptically released Zn ²⁺ 。文章的通讯作者是匹兹堡大学听力研究中心的 Thanos Tzounopoulos 教授和弗吉尼亚大学的 Hui-wang Ai 教授，前者主要研究方向是开发治疗耳鸣和听力受损的药物，后者主要研究方向是开发新型分子传感器来对神经元活动以及氧化还原信号进行检测。

在神经系统中，锌离子参与很多重要的信号传递过程，突触锌离子信号传导的失调和很多神经疾病相关，因此对突触中的 Zn ²⁺ 进行成像很有意义。之前研究开发的组织中锌离子的成像方法很多都不能用于活体中，最近很多研究集中在遗传编码可以和锌离子结合的荧光蛋白，从而进行荧光成像上。作者之前就设计了几种可以与锌离子结合从而产生荧光的荧光蛋白指示剂，但是这些指示剂具有稳定性差以及动态范围小的问题，并且这些荧光蛋白在突触成像中不成功，因此 作者计划设计一种可以用于突触锌离子成像的指示剂 。

作者之前开发的锌离子响应的 FPs 是将锌指结构插入到 GFP 的 β7 链上，从而在 Zn ²⁺ 存在下诱导锌指结构二聚，产生荧光，而这里作者为了提高其动态范围，使用远红色的荧光蛋白 mMaroon1 来代替 GFP ，从而使其激发和发射波长符合预期。作者首先筛选发现 mMaroon1 具有可以用于插入锌指区域的变体 cpmMaroon185-186 ，作者插入后发现 Zn ²⁺ 加入与否会使荧光强度变化 40% ，之后作者进行 11 轮定向进化来提高改造的 FPs 对锌的响应，最终响应能力提高了 8 倍。最后考虑到此蛋白之后需要定位在突触膜上，防止 Cys 被氧化，作者将锌指的四个 Cys 突变成 His ，没有明显改变动态范围，作者将这个蛋白命名为 FRISZ 。

在得到 FRISZ 之后，作者将其纯化后对其生物物理性质进行分析，证明了其会且只会响应 Zn ²⁺ 。之后作者使用 pDISPLAY 质粒将该蛋白编码到哺乳动物细胞外膜上，证明了 FRISZ 可以对细胞外膜的 Zn 进行成像。随后在小鼠脑切片实验中证明了 FRISZ 可以对脑切片电刺激产生的 Zn ²⁺ 进行检测，最后对清醒的小鼠进行实验，证明了 FRISZ 可以检测清醒小鼠响应声音后突触产生的 Zn ²⁺ 变化。