哈佛团队研发新型CMOS芯片，成功监测超数千只老鼠神经元，且实现90%的平均细胞内耦合率

近日，美国哈佛大学团队研发出一种使用 CMOS 工艺制造的微孔电极阵列，其能用于并行细胞内记录，从而用于突触连接映射。当将这一阵列和微孔-神经元接口以及电流钳电子器件结合一起， 能在大鼠神经元培养中实现 90% 的平均细胞内耦合率，从而能够生成包含丰富突触信号的细胞内记录数据。 （注：CMOS 的英文是 complementary metal-oxide semiconductor，中文翻译为互补金属氧化物半导体）。

（来源： Nature Biomedical Engineering ）

从这些数据中，研究人员提取出 2000 多个神经元中的 70000 多个合理的突触连接，总体误差率大约为 5%。对于体外大鼠神经元，CMOS 微孔阵列平均实现了 90% 的细胞内耦合率，在最好的情况下为 97%，平均细胞内记录振幅和细胞内耦合持续时间大约是此前方法的五倍。

同时，它还可以在相同的神经元上恢复细胞内耦合，而采用更具侵入性的传统纳米针阵列则很难实现这一效果。这种映射规模远远超过了任何其他电极技术能够实现的规模。要知道 CMOS 纳米针阵列只能绘制大约 300 个突触连接的，而低通量膜片钳和突触不敏感的微电极阵列的效果更差。

与此同时，本次 CMOS 微孔电极阵列的可用性和性能均优于 CMOS 纳米针阵列，它能将并行细胞内记录变得简单易用，并且仍能实现强大的突触连接映射。

另外，它的微孔不仅更加容易制造，还可以广泛使用。总的来说，这种规模的突触连接性绘制以及表征突触连接的能力，让人类朝着大规模神经元网络的功能连接性绘制迈出了新的一步。

日前，相关论文以《通过微孔电极阵列的并行化细胞内记录来映射数千个神经元之间的突触连接》（ Synaptic connectivity mapping among thousands of neurons via parallelized intracellular recording with a microhole electrode array ）为题发在 Nature Biomedical Engineering （IF 26.8）。

图 | 相关论文（来源： Nature Biomedical Engineering ）

哈佛大学 Jun Wang 是第一作者，哈佛大学朴洪坤（ Hongkun Park ）教授和韩德熙（ Donhee Ham ）教授担任共同通讯作者 [1]。

图 | 韩德熙（Donhee Ham）（来源：资料图）

突触连接映射的需求仍未得到满足

长期以来，电极一直是了解神经元及其网络的窗口。一方面，膜片钳电极具有细胞内记录功能，可以高灵敏度地测量从一个到几个神经元的小突触信号。

另一方面，微电极阵列（MEA，micro electrode array）可以在细胞外并行记录许多神经元，但是它对于突触信号缺乏敏感性。

在微电极阵列类似的并行性条件下实现类似膜片钳的细胞内灵敏度，可能为观察和探究神经网络中大量突触信号开启一扇新窗口，有助于绘制出该网络的突触连接图并明确其连接强度特征，这也是神经科学领域长期以来的一个研究课题。

因此，细胞内神经元记录的并行化一直是领域内所努力实现的目标。但是，事实证明它非常具有挑战性。对于各种类型的非膜片钳电极来说，就算使用单个神经元，也很难真正地检测突触信号的细胞内记录。

2020 年，该团队通过在具有 4096 个记录位点或像素的 CMOS 电子芯片上开发垂直纳米针电极阵列，借此在并行细胞内神经元记录上取得了显著进展。

在使用电流钳同时进行电流注入和电压记录操作中，由 CMOS 电路操控的纳米针电极实现了细胞内记录，从而能在单个像素上检测到突触信号，并且该阵列能够支持并行操作。

当时，研究人员发现在最好的情况下，其能在 4096 像素的细胞内记录 1728 个体外大鼠神经元中，并借此发现了 304 个突触连接。而膜片钳只能在细胞内记录一到几个神经元，因此这远远超出了膜片钳的能力范围。

尽管这一进展意义重大，但是这种 CMOS 纳米针阵列既不具备日常使用的便利性，也不具备并行细胞内记录的流畅性。由于纳米针的制造过于困难，因此无法广泛应用，而且当时这一设备仅能实现 5.8% 的平均细胞内耦合率。虽然其性能是当时最先进的，但仍然远远不能满足突触连接映射的需求。基于此，研究人员开展了本次研究。

（来源： Nature Biomedical Engineering ）

六个单孔芯片的平均细胞内耦合率为 58%

在本次研究中，研究人员由代工厂制造了这款 CMOS 芯片，在其表面上具有 64×64=4096 个铝像素焊盘，每个铝焊盘用 2.6µm 厚的 SiO ₂ /Si ₃ N ₄ 钝化。

为了在每个焊盘上制造微孔电极，研究人员在钝化层中蚀刻一个 1.2µm 深、10×10µm² 宽的阱，在阱中心蚀刻一个 1.4µm 深的孔，以便暴露下面的铝金属，并能针对 Pt/Ti 进行沉积。同时，他们在铂表面的孔上电沉积铂黑（PtB，platinum black），以便增加电极的表面粗糙度，进而增加其表面积和电导率。

研究人员表示，这种微孔电极的制造比垂直纳米针电极的制造简单得多。同时，单个神经元就能针对微孔实现完全覆盖，这能减少为了启动和维持细胞内记录所需的膜通透性电流注射量。

除了偶尔的脉冲之外，微孔阵列每像素注入的电流大小，平均比纳米针阵列大约减少五分之四。这些减少的电流不仅能够减缓电极的劣化，而且由于对于电解质造成的化学扰动较小，因此所产生的气泡也较少，同时还能减少对于细胞的干扰。这在很大程度上解释了微孔阵列细胞内耦合持续时间和速率能够得到大幅提高的原因，也解释了其重新获得细胞内耦合能力的原因。

同时，研究人员还开发了每个像素具有短路多孔电极的器件。单孔芯片每像素电极分布较小，而多孔芯片的每像素电极分布较宽，因此可以作为单孔芯片的衬底。

随着向细胞内记录的转变，动作电位呈现正极性，其振幅增长了一到两个数量级。实验中，研究人员发现了一些小的突触信号，比如突触后电位（PSP，postsynaptic potentials）和其他亚阈值事件。

尽管电流注射一直在持续进行，但是细胞内信号最终还是在记录轨迹中丢失，研究人员将记录迹线中细胞内信号的丢失视为细胞内偶联的丢失。然后，他们将六个单孔芯片与体外大鼠神经元连接，并在大量像素下进行这种细胞内记录。

在前 20 分钟的运行中，六个单孔芯片的平均细胞内耦合率为 58%，这远远超过了纳米针阵列的平均值。整个实验运行时长超过 60 分钟，六个单孔芯片的细胞内偶联率平均达到 90%，最高达到 97%。

这六个单孔芯片的细胞内记录质量也优于纳米针阵列。 细胞内记录的动作电位的平均幅度为 4.7 毫伏，细胞内耦合平均持续时间为 32 分钟。

四个多孔芯片也都成功实现了大规模并行细胞内记录，其平均细胞内偶联率为 71%，持续时间为 13 分钟，动作电位振幅为 0.9mV，这远远低于六个单孔芯片。

下图 b 比较了单个单孔像素和多孔像素的记录轨迹示例，而图 e-h 则针对六块单孔芯片和四块多孔芯片的细胞内耦合速率、持续时间和动作电位幅度进行了比较。这些结果证实了单孔芯片中小电极分布范围的好处。

（来源： Nature Biomedical Engineering ）

有趣的是，虽然多孔芯片在所有细胞内记录指标上平均不如单孔芯片，但前者往往表现出相对较少的芯片间差异，从而在耦合持续时间和幅度上表现出像素间的差异。

研究人员还进行了另一个对照实验，旨在展示孔嵌套孔电极的可能优势。为此，他们制备出另外三个单孔芯片，这些芯片的孔电极周围没有设置小阱。

完成制备之后，研究人员进行了三组全阵列范围的细胞内记录。在细胞内偶联位点总数和细胞内偶联强度等性能指标上，那些孔电极直径 d′=5 微米并且孔电极嵌套于小阱中的单孔芯片，往往要比对照组的单孔芯片有着更好的表现。

例如，前者的细胞内偶联强度平均约为两倍，这表明孔的存在可以提高密封阻力。也就是说，与垂直纳米针电极相比，嵌套在孔中的单孔电极的改进，主要归因于单孔电极的小范围分布。

如前所述，单孔芯片的细胞内耦合持续时间的显著改善，是由于单孔电极被神经元完全覆盖的可能性更高，因此电流钳所需的电流注入更小、侵入性更小。然而，整体的小电流注入不是恒定的，而是变化的。

最初较大的电流有助于加速膜透性，以便快速获得细胞内偶联。而随后较小的电流一方面用于维持获得的透性从而维持细胞内偶联，另一方面用于减缓电极劣化。然而，较大的初始电流不一定能保证细胞内耦合，稍后注入较小的电流可能会逐渐发生细胞内耦合。

AI 和神经形态计算均可从本研究受益

总的来说，大规模突触连接和连接强度的绘制，可以使 AI 和神经形态计算等研究受益，并可能在筛选药物对于神经网络的影响上找到生物医学应用。而本次由 CMOS 驱动的微孔电极阵列为这种突触连接映射提供了一条途径。一方面它易于操作，另一方面它能够对神经网络进行宏观细胞内记录。

通过在可插入大脑的三维绝缘棒阵列（而不是二维平面）上制造大量微孔电极，并将其应用于体内记录，不仅可以增加每个神经元发现的突触连接的平均数量，还可以将突触连接结构与网络行为联系起来。通过简单地增加电极数量，可以进一步增加每个神经元发现的突触连接的数量。

虽然用于电流钳制的集成放大器和电流注入器的数量无法像电极数量那样很好地扩展，但可以利用开关矩阵技术，使用有限数量的有源电路来驱动更多的电极。不过，研究人员表示，此次展示的从全网络细胞内记录数据绘制突触连接的过程只是一个开始，未来他们还将基于大数据开发更加复杂的映射技术。