专栏名称: 细胞基因研究圈

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Transgene-free柑橘新突破！王年团队利用Cas12a/CBE共编辑策略创制无转基因抗溃疡病柑橘新品种！

细胞基因研究圈 · 公众号 · · 2024-04-01 15:25

正文

研究背景

柑橘是全球种植最多的水果之一，但面临许多生物和非生物胁迫，迫切需要培育新的柑橘品种来应对这些挑战。柑桔溃疡病会严重影响柑橘生产。该病由柑橘黄单胞菌(Xcc)引起。之前的研究证实，在Xcc感染过程中，PthA4会从病原体转运到寄主植物细胞中，结合到LOB1的启动子效应元件 (EBEPthA4-LOBP)上，激活LOB1的表达并最终导致溃疡病。之前，Cas12a/CBE共编辑方法被用于破坏柚的EBEPthA4-LOBP元件。然而，大多数商业化柑橘品种是杂交异源二倍体，产生纯合/双等位突变体相对更加困难。并且，上述通过基因编辑获得的抗病柑橘植株均为转基因材料，由于监管和公众接受度方面的顾虑，尚未商业化推广。无转基因编辑技术则很有希望克服这一瓶颈。

2024年3月26日，Frontiers in Plant Science（IF:5.6）在线发表了美国佛罗里达大学王年团队的最新研究进展:“Generation of transgene-free canker-resistant Citrus sinensis cv. Hamlin in the T0 generation through Cas12a/CBE co-editing”。在这项研究中，作者采用Cas12a/CBE共编辑方法编辑世界性商业柑橘品种Hamlin的EBEPthA4-LOBP元件，成功的编辑了柑橘溃疡病基因LOB1的EBEPthA4元件，并在T0代终获得了无转基因的编辑品种。

作者首先构建了载体GFP-p1380N-ttLbCas12a:LOBP1-mPBE:ALS2:ALS1。该质粒的各部分具有以下的功能: GFP基因，用于通过绿色荧光选择非转基因再生株；nCas9-mPBE基因，编辑ALS产生对草铵膦抗性的再生株，作为基因组编辑的选择标记；ttLbCas12a基因，编辑目的基因EBEPthA4-LOBP（Fig1A）。Hamlin是柚(C. maxima)和柑橘(C. reticulata)的杂交品种，为杂合二倍体。作者针对Hamlin的基因组设计了不同的sgRNA来靶向CsLOBP与CsALS来进行编辑（Fig1B）。

Fig1

构建好载体后，作者利用xcc介导的农杆菌浸润法在柑橘叶片上进行验证。成功表达了GFP，证明质粒在柑橘中能够正常表达。通过对GFP表达区域的sanger测序结果显示，在100个单克隆中，有1个菌落含有ttLbCas12a介导的EBEPthA4-LOBP缺失突变，并且也观察到了有单克隆含有nCas9-mPBE介导的ALS碱基编辑突变。上述结果证实，GFP-p1380N-ttLbCas12a:LOBP1-mPBE:ALS2:ALS1质粒能够同时在柑橘中编辑EBEPthA4-LOBP和ALS两个目标位点，验证了载体的可行性（Fig2）。

Fig2

接下来作者利用该载体，在柑橘中利用农杆菌介导转化。共获得77株再生植株，其中8株为GFP阳性转基因植株，69株为GFP阴性植株（Fig3）。在69株GFP阴性植株中，4株(#Ham NoGFP 1-4)含有ALS和EBE PthA4 -LOBP的编辑突变，被鉴定为转基因无编辑植株。并且其中3株为EBE PthA4 -LOBP双拷贝突变体，1株为纯合突变体。

Fig3

并且，作者通过接种柑橘疫病菌，证实这4株无转基因植株、编辑了EBE PthA4 -LOBP的植株对柑橘疫病具有抗性（Fig4）。通过全基因组测序分析也证实#Ham NoGFP 4不含有外源DNA序列。

Fig4

总结

在这项研究中，作者成功利用共编辑策略将ttLbCas12a与单碱基编辑器nCas9-mPBE和GFP选择相结合，通过瞬时表达在T0代中获得了无转基因的抗溃疡病Hamlin品种。在之前的研究中，共编辑方法被用于获得无转基因的烟草、番茄、马铃薯。本研究进一步证明，共编辑策略可用于通过T0代转基因无基因编辑改良具有杂种优势的柑橘优良品种。总之，作者优化的共编辑方法为一步获得转基因无基因编辑柑橘提供了一种经济高效的途径。该策略有望扩展应用于其他作物，尤其是那些有较长休眠期或必须通过营养繁殖获得的作物。

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