细胞工匠|一种新的细胞扩大方法

一个典型的细胞培养过程从细胞解冻复苏开始，随后通过连续传代培养对细胞进行扩增，可选用的培养设备包括摇瓶、细胞培养转瓶、WAVE波浪袋生物反应器和机械搅拌生物反应器等。当细胞培养体积和细胞密度达到预定标准时，细胞将转入到生物反应器中继续生长并表达产物。这种方法目前还面临着一些挑战。 

摇瓶和转瓶是细胞放大培养初期使用的主要设备，这两种设备都需要在超净工作台中手动操作，这种情况下容易出现污染，而且易受操作者失误影响。此外，传统的细胞库保存细胞时，冻存管内细胞数量较少，细胞在放大过程中耗时较长。生产用生物反应器体积非常大，需要许多中间型号的培养设备来将种子细胞按比例放大，这将导致需要更长的放大培养时间，并使情况变得更加复杂。生物反应器接种活细胞密度通常低于0.5 × 10⁶ cell/mL,接种细胞后需要培养生长5-10天。在细胞生长期内，由于细胞密度达不到标准不能表达产物或产物含量低，这段时间不能产生实用价值 。

有研究表明，建立高密度细胞库可以减少细胞放大的步骤并提高细胞放大成功率。Tao et al.等人建立了高密度细胞库，每冻存管中活细胞量达到4.5× 10⁸ 个，细胞复苏后直接接种到20L的WAVE波浪袋生物反应器中。这项研究表明，使用高密度细胞库可以减少中间摇瓶放大步骤并且节约9天的细胞扩大培养时间。Heidemann et al. 等人使用高密度细胞库配合几种不同大小的一次性生物反应器对细胞进行放大培养，减少了60–70%的培养时间。

  一次性生物反应器相比不锈钢生物反应器具有许多优点，例如灵活性大大增强，节省安装、清洗和灭菌时间，减少资本投资等。GE公司的一次性WAVE波浪生物反应器常常用于种子细胞的扩大培养，该种反应器可以大大减少污染风险（通常不需要在层流罩下工作），而且不需要安装、清洗和灭菌等操作。

  目前工业化生产中，细胞灌注培养越来越受到人们关注。一些公司已经成功的将细胞灌注培养用于商业化生产中。使用灌注培养可以在较小体积的生物反应器中获得高的细胞密度，相比批次培养和流加培养能更快的收获培养中的不稳定产物。由于这些和其他特点，灌注培养常常在最终生产产品的生物反应器上使用，而不在细胞扩大过程中使用。

Whitaker and Heidemann简单提及过灌注培养在细胞扩大过程中的应用，但他们没有讨论灌注培养在改进终端细胞种扩大、减小生物反应器大小、减少生物反应器培养步骤和减少细胞在生产用生物反应器中细胞生长阶段时间等方面的潜力。Pohlscheidt使用了一台带有倾斜细胞沉降装置的3000L生物反应器进行细胞灌注培养，细胞密度达到15.8 × 10⁶个/mL, 相比流加培养减少了20%的培养时间。然而，由于细胞分离器对流加速率的限制，细胞长期在次优的条件下生长，想要进一步提高细胞密度变得相当困难。

在这里，我们描述了一种新的细胞扩大方法，该方法需要使用到高密度细胞库、一次性波浪生物反应器和交替切向流（ATF）灌注培养技术。图1中比较了一个用常规方法将细胞扩大到500L生产用生物反应器（n）中的例子。使用高密度细胞库方法减少了中间两个转瓶培养的步骤，可以直接接种到2L的波浪生物反应器中。使用波浪生物反应器（2L和20L）代替转瓶（125ml到10L）大大减少了需要在超净台中操作的次数。这种替换使整个过程在一个封闭系统中进行，提高了操作成功率。ATF灌注培养技术在n-1级生物反应器（图中为带有ATF灌注装置的50L生物反应器）的应用能使细胞密度大于50×10⁶个/ml。这种细胞扩大方式将使得500L生物反应器接种细胞密度达到5×10⁶个/ml，远远超过常规培养时的接种密度0.5×10⁶个/ml。更高的接种细胞密度可以为500L生物反应器减少5天细胞生长时间，可以为500L生物反应器生产线节省50天操作时间。

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我们解冻一支高密度细胞冻存管(10×10⁷ 个活细胞/ml, 4.5mL/支) 直接接种2L波浪袋生物反应器 (GE Healthcare Life Sciences)，工作体积为1L。当细胞密度达到3.0×10⁶个/mL时，我们将细胞扩大到20L波浪袋生物反应器中培养，工作体积为7.5L。一个20/50 EHTD Wave生物反应器系统(GE Healthcare Life Sciences) 作为2L和20L生物反应器摇摆平台，控制培养温度37°C,摇晃速度16rpm，摇晃角度7°， 20% 的O₂ 和 5% 的CO₂ 混合气体以0.25 slpm的速度进入顶部空间。

我们使用了一台15 L玻璃生物反应器(Broadley-James Corporation)，配备了ATF4灌流装置来模仿n- 1细胞种扩大阶段(图1中的50L生物反应器)。一个20um的微孔进气管加氧气，控制溶解氧(DO)在40 %；一个1mm孔径的进气管加氮气，控制溶解的co₂水平< 120mmHg压力。根据需要，我们添加了0.5M碳酸钠以保持Ph > 6.85 ,添加10 %消泡剂(Life Technologies)控制泡沫水平。

我们使用一台15L的生物反应器进行细胞培养，工作体积为10L，接种细胞密度0.5×10⁶个/ml，批次培养两天后开始灌注培养。在开始，使用一个活细胞浓度在线分析电极(Aber Instruments)和可编程逻辑控制程序(Emerson Process Management)控制灌注速率为0.2 nL/cell/day。当活细胞浓度达到20×10⁶个/ml时，限制灌注速率为每天4个工作体积。

当n-1级种子反应器中细胞密度达到25×10⁶、50×10⁶、100×10⁶个/ml时分别取样，接种到50ml转管（TPP Techno Plastic Products）中，接种密度为0.5×10⁶、2.5×10⁶、5.0×10⁶个/ml三种不同密度类型，工作体积为10ml，每个培养管做3份平行样。由于转管不能做灌注，采取每天换液的方式培养。从第一天开始给转管更换培养基，更换方法是将转管从培养箱拿出后用1100rpm离心5min，弃上清，加入新鲜培养基重悬细胞。这种换液策略能够保证接种不同浓度细胞的转管具有相同的换液速率。转管在高频脉冲恒温摇床（HT Infors）中培养，培养条件为37°C，摇晃频率160rpm，角度45°，相对湿度80%， CO2浓度5%。

我们采用一台15L的生物反应器（Broadley-James Corporation）来模拟图1中的500L生物反应器，工作体积为10L，配备了ATF4灌流装置(Refine Technology)和0.2um孔径的PES材质过滤器。一个20um的微孔进气管加氧气，控制DO为40%，一个1mm孔径的管加氮气，，控制溶解的co₂水平< 120mmHg压力，添加了0.5M碳酸钠以保持Ph > 6.85 ,使用蠕动泵添加10 %消泡剂(Life Technologies)控制泡沫水平。

一套生产用生物反应器接种批次培养获得的种子细胞，细胞接种密度较低(5.0×10⁶个/ml)。培养一天后开始灌注培养，灌注速率为0.5个培养体积/天，然后每天增加0.5个培养体积，直到灌注速率达到2个培养体积/天。另一套生产用生物反应器接种n-1灌注种子罐培养获得的细胞，细胞接种密度较高（5.0×10⁶个/ml）。由于接种密度较高，接种细胞的同时开始进行灌注培养，灌注速率为2个培养体积/天。两套生物反应器安装活细胞浓度在线分析电极，使用该电极和蠕动泵控制活细胞浓度在40×10⁶个/ml，培养运行50天。

我们使用ViCell XR细胞存活率分析仪(Beckman Coulter)检测活细胞浓度，使用RAPIDLab血气分析仪(Siemens)离线检测pH and pCO2，使用特异光度酶活性分析法定量蛋白质含量。

在n-1细胞种生物反应器中使用ATF灌注方法进行高密度细胞培养：图2展示了包括波浪袋生物反应器和n-1生物反应器在内的细胞种活细胞密度曲线。2L的波浪袋生物反应器培养8天，20L的波浪袋生物反应器培养5天，n-1生物反应器培养12天，最终细胞密度达到110×10⁶个/ml，细胞存活率大于98%。在培养9天后，细胞密度达到50×10⁶个/ml，可以满足接种500L反应器时接种密度达到5×10⁶个/ml（假设n-1反应器体积为50L）。

从培养2天后开始，n-1生物反应器维持灌注速率为0.2 nL/cell/day，补料速度随着细胞密度升高而自动加快。成功使用这种补料策略需要活细胞浓度在线分析电极能精确的测定出活细胞的浓度。在这里，我们仅仅使用这种策略持续到第7天，然后将灌注速率改为4个培养体积/天。在细胞生长期使用这种控制策略可以精确的控制灌注速率，有利于细胞生长。之前有报道表明，0.05–0.10 nL/cell/day 的灌注速率差异会对细胞生长和产品表达产生影响。我们的策略中，灌注速率随细胞生长自动调整，可以避免这种差异造成的影响，相比之下，在批次逐步放大过程中，操作人员需要手动调节速率。

我们使用一个小型的转管模型来推断n-1种子反应器中细胞密度是如何影响终端生产用生物反应器内细胞生长的。当n-1反应器中细胞密度达到25×10⁶、50×10⁶、100×10⁶个/ml时分别取样，每种样品接种到三个转管中，接种密度为0.5×10⁶、2.5×10⁶、5.0×10⁶个/ml三种不同密度类型，每个培养管做3份平行样。每天更换培养基，更换培养基频率根据接种细胞密度进行调整，保证每个培养转管在相同细胞密度下有同样的灌注速率。

图4比较了不同接种密度条件下细胞的数量和活力。由于转管最大灌注速率为1个培养体积/天，为了和生物反应器相匹配，我们仅仅将细胞密度培养到20×10⁶个/ml。我们观察到不同细胞密度取样和三种不同接种密度对细胞生长没有明显影响，但是在n-1种子反应器中细胞密度为100×10⁶个/ml时取的样品在接种初期细胞活力相对较低。

为了研究n-1反应器的细胞传代密度和生产反应器的接种密度对细胞生长和生产率的影响，我们做了相应的对比实验。一组采用n-1反应器细胞密度50×10⁶个/ml时传代，接种密度为5×10⁶个/ml。另一组采用n-1反应器细胞密度2.5×10⁶个/ml时传代，接种密度为0.5×10⁶个/ml。图5对这两种情况进行了比较。在整个50天培养过程中，两种接种条件的细胞都保持了90%以上的细胞活力。图6表明的是在不同接种条件下特定产物和细胞总量之间的对应关系。很明显，在接种密度高的情况下，细胞密度稳定在40×10⁶个/ml（图5）并高浓度表达产物的时间提前了4到5天。

我们的细胞扩大方法在经济和操作两方面都具有优势。例如以5×10⁶个/ml细胞密度接种500L生物反应器可以减少4-5天细胞培养时间，相比50天的培养周期提升了10%的生产力。我们已经实现在n-1阶段反应器上将细胞密度培养到100×10⁶个/ml，如果使用10×10⁶个/ml细胞密度接种500L生物反应器，可以再减少5-6天细胞生长时间。如果终端生产生物反应器使用的时批次或者流加工艺，这种细胞扩大方法同样可以用来提供种子细胞。如果一个流加培养的500L生物反应器培养周期为21天，使用5×10⁶个/ml细胞接种密度可以缩短25%的培养时间，这样每年可以多生产5-6批产品，提升25%-30%的生产效率。

通常情况下，批次培养和流加培养比灌注培养需要更大体积的生物反应器，细胞放大过程需要多级不同型号生物反应器。图7对常规放大过程和流加反应器放大过程接种10000L生产反应器进行了比较。在n-1阶段使用50L生物反应器灌注培养，细胞密度达到50-100×10⁶个/ml时接种10000L生物反应器，接种密度为0.25-0.5×10⁶个/ml，这样可以减少两个中间放大步骤。这种方法的好处是可以减少250L的反应器和500L的反应器，节省使用空间，同时大量减少前期资本投入。

我们的研究结果表明这种新的细胞扩大方式是完全可行的，这种方法需要使用高密度细胞库、一次性反应器和n-1阶段生物反应器灌注技术。这种新的细胞放大程序减少了一些细胞放大步骤，省略了许多清洗、安装和灭菌过程，大大简化了细胞扩大程序。工业化生产可以使用同样的操作策略，用50L的生物反应器替代n-1阶段设备，用500L的生物反应器替代终端生产生物反应器。

在n-1阶段生物反应器上使用ATF灌注技术，培养12天后细胞密度不超过100×10⁶个/ml，此时进一步放大培养不会改变细胞生长特性。我们的研究表明，使用5×10⁶个/ml细胞密度接种500L生物反应器可以使细胞培养扩增时间减少4-5天，从而使50天的培养周期中生产生物产品时间提高10%。在n-1阶段使用灌注技术的方法可以可以有多个变种，例如可以使用500L生物反应器作为n-1阶段细胞种子反应器，接种细胞密度提高到10×10⁶个/ml。相比批次培养和流加培养，当使用更大的生物反应器生产时（比如10000L）,我们可以在n-1阶段使用50L灌注生物反应器作为种子反应器，通过提高细胞密度减少传代扩大步骤。