Sci Adv：NF-κB在椎间盘内的过度激活导致巨噬细胞聚集和严重的椎间盘退变

(Kevin G B, Min K M K, Nadeen O C I, et al . Nuclear factor κB overactivation in the intervertebral disc leads to macrophage recruitment and severe disc degeneration. Sci Adv 2024, 10(23): eadj3194)

慢性炎症与严重的椎间盘退行性病变（ IVDD）有密切关系。近期，研究人员通过小鼠模型，利用基因靶向表达聚集蛋白聚糖来激活经典的核因子κB（ NF-κB ）通路，探究了 NF-κB 持续激活对椎间盘退变的影响。研究结果显示， NF-κB 的持续激活引发了严重的结构性退变，同时伴随炎症分子（如 Il1b、Cox2、Il6、Nos2 ）、趋化因子（如 Mcp1、Mif ）以及分解酶（如 Mmp3、Mmp9、Adamts4 ）基因表达的增加。在尾椎间盘中，观察到促炎（ F4/80+ ， CD38+ ）和抑炎（ F4/80+ ， CD206+ ）巨噬细胞数量的增加。炎症发生后，尾椎间盘细胞的分泌物进一步促进了巨噬细胞的迁移和炎症激活能力。值得注意的是，腰椎间盘并未表现出相同的表型变化，这表明脊柱不同区域对炎症基因过度激活的反应存在差异。 研究结果表明， NF-κB的持续激活提升了炎症因子、趋化蛋白和分解酶的表达，增强巨噬细胞的募集和活化，从而导致严重的椎间盘退行性病变。

为了验证在小鼠椎间盘（ IVD）中Cre介导的基因重组是否成功，研究将一种带有 Acan CreERT2 构造的小鼠与 Ai14 荧光报告基因小鼠进行杂交（ AcanCre +/− ;Ai14 ）。随后，通过腹腔注射他莫昔芬对椎间盘组织进行评估。结果表明，小鼠尾部和腰椎间盘的不同区域均检测到指示 Cre 活性的红色荧光蛋白（RFP）的表达（见图1）。腹腔注射他莫昔芬3天后，在尾部椎间盘的所有组织隔室（包括髓核NP、纤维环AF、软骨终板EP及椎体生长板GP）中均观察到RFP的表达（图1B），并在3个月后仍然可见（图1D）。同样，RFP可在腰椎椎间盘的所有组织隔室（包括NP、AF、EP和GP）中表达，并持续表达至注射后3个月（图1F）。相比之下，未表达Cre的对照小鼠（ AcanCre ;Ai14 ）在尾部和腰椎椎间盘的任何组织中均未检测到 RFP表达（图1A、图1C、图1E）。这些结果表明，带有 Acan CreERT2 构造 的小鼠成功实现了椎间盘组织的靶向基因重组，并成功诱导了 Cre活性。

图 1. AcanCreERT2 构造的小鼠靶向 IVD和GP的所有区段。

为验证在 Cre下游 NF-κB 的激活情况，研究人员在小鼠基因重组 1周后，对腰椎和尾椎间盘中 IKKβ 基因的表达情况进行评估。结果表明，与对照组相比， IKKβ 持续活化（ IKKβCA ）的 小鼠尾椎间盘中 Ikk2 基因表达显著上调约 8倍，而腰椎间盘中的 Ikk2 基因则上调约 3倍，这表明在尾椎间盘中 NF-κB 的激活更为显著。此外， IKKβ CA小鼠重组4个月和6个月后，在尾椎间盘的免疫荧光染色结果中发现 p65 亚基被激活，磷酸化 p65 的表达水平显著增加，表明 IKKβ CA小鼠中 NF-κB 信号通路被持续激活。上述结果表明，尾侧区域的 IKKβ 结构性激活显著增强，进一步导致了下游 NF-κB 信号通路活性的增加。重组小鼠尾部和腰部 IVD不同区域的磷酸化 p65 水平随时间呈动态变化（见图 2），其中在尾部IVD的所有组织隔室（包括髓核NP和纤维环AF）中，磷酸化 p65 水平显著增加，并在激活后 1个月达到峰值（A F 中）（图 2C），而在髓核区域，磷酸化 p65 的核内荧光强度在激活后 4个月显著上升（图2D）。相比之下，在腰部IVD中，磷酸化 p65 主要分布于 AF和NP区域，并在激活后1个月即可检测到其表达（图2C），但其总体水平低于尾部IVD，且未表现出显著的时间相关性变化（图2D）。这些结果表明，在尾部IVD中 IKKβ 的激活更为显著，可能是由 Cre激活效率、分子信号差异或细胞密度变化等多种因素共同驱动的。

图 2. 在 IKKβ CA小鼠体内， IKKβ 的过表达导致了 NF-κB 的激活。

随后，研究人员分析了 NF-κB 激活引发的基因表达变化。结果显示，在 NF-κB 激活后，他莫昔芬诱导的 IKKβ CA小鼠重组4周后尾椎间盘内的多种基因表达显著上调，包括促炎细胞因子（如 Il1b、Cox2、Il6 和 Nos2 ）、趋化因子（如 Mcp1 和 Mif ）以及分解酶（如 Mmp3 、 Mmp9 和 Adamts4 ）（见图 3）。

图 3. IKKβ过表达上调炎性细胞因子、趋化因子、分解酶和神经营养因子基因的表达。

接下来，本文通过分析尾侧静脉运动节段的组织退行性形态变化，评估 NF-κB 介导的炎症对尾部静脉完整性的影响。 IKKβ CA小鼠在重组1个月和2个月后尾部椎间盘出现轻微的退行性改变，具体表现为髓核（NP）细胞密度减少和聚集，以及纤维环（AF）同心层结构的丢失（图4A）。 IKKβ CA小鼠在重组4个月和6个月后，表现出严重的尾部椎间盘退变组织学特征，包括髓核细胞密度显著减少、髓核组织染色消失、髓核与纤维环边界破坏（图4A和4D）；此外，尾部椎间盘的纤维环显示出内层细胞减少、层状结构断裂，靠近髓核边界的区域出现圆形细胞，同时尾部椎间盘的软骨终板（EP）表现出细胞浸润、裂隙和微骨折（图4A）。这些退变特征表明长期的 NF-κB 激活导致了尾部椎间盘所有组织隔室的结构严重受损（图 4B和4C）。

图 4. IKKβ过表达导致严重的尾部椎间盘退变。

然而， IKKβ CA小鼠重组6个月后，与尾部脊柱相比，腰椎IVD并未表现出退行性表型。 IKKβ CA小鼠和对照组的腰椎间盘都显示了正常的椎间盘结构。尽管Cre在整个腰椎IVD中具有活性（图1F），并增强了 Ikk2 基因及多个下游致炎基因的表达（图 3），但在腰椎区域观察到的腰椎间盘（IVD）解剖形态仍保持正常（图5A），具体而言，髓核（NP）、纤维环（AF）和软骨终板（EP）等组织结构在组织学评分中没有显现退行性改变的特征（图5B）。这一结果表明，在该模型中IVD对促炎信号的响应存在区域性差异。相比之下，尾部IVD显示出显著的退行性改变，例如髓核细胞密度的显著降低（图4F）以及纤维环结构的明显破坏（图4A），这进一步强调了尾部与腰椎区域在促炎基因表达和组织学形态方面的差异性。

图 5. IKKβ 过表达 6个月后，腰椎间盘的结构未表现出明显改变。

鉴于尾部椎间盘中出现了显著的表型变化，研究人员进一步分析了 IKKβ CA小鼠尾部椎间盘的机械和结构特性变化。结果表明， NF-κB 的长期激活促使细胞外基质的重塑，并导致纤维环（ AF）组织向髓核（NP）区域移位，使NP逐渐表现出纤维化结构。组织学分析显示， IKKβ-NF-κB 的过度激活在尾部椎间盘（ IVD）中引起了严重的椎间盘退变（IVDD）。具体来说，在 阿利新蓝 （图 6A）和天狼星红染料（图6B）染色的组织切片中，观察到NP区域糖胺聚糖（GAG）含量的显著丢失和胶原分布的异常变化，纤维环的层状结构也出现明显破坏（图6A，图6B）。此外，通过荧光显微镜观察发现， IKKβ CA小鼠的尾部IVD高度显著降低（图6C），量化分析证实在重组后3个月和6个月的时间点尾部IVD高度较对照组显著下降（图6D）。这些结果表明， IKKβ-NF-κB 的持续过度激活对 IVD的结构完整性和功能特性产生了破坏性影响。

图 6. IKKβ 过表达介导尾部 ECM 损失、椎间盘高度 下降 和机械性能减弱 。

除了 IVD组织的退行性变化外，H&E染色结果显示，在所有时间点上， IKKβ CA小鼠尾椎间盘的外层纤维环（AF）区域细胞密度均有所增加。为进一步探究这些细胞群的特性，研究人员使用免疫染色法检测泛巨噬细胞标志物F4/80的表达。结果表明， NF-κB 的过度激活不仅诱发了炎症反应，还通过促进巨噬细胞的募集和活化，加剧了椎间盘的退行性改变（见图 7）。在尾部椎间盘（IVD）的纤维环（AF）和软骨终板（EP）区域观察到F4/80 + 巨噬细胞的显著增加（图 7A-B）。然而，在髓核（NP）区域，未观察到巨噬细胞表达的组间差异（图7A-B）。这些结果进一步证实了 NF-κB 过度激活在椎间盘组织内引发免疫细胞募集和炎症性改变的关键作用，并呈现出组织隔室的特异性响应模式。

图 7. IKKβ 过表达会显著增加尾部椎间盘（ IVD）中巨噬细胞的数量，并伴随表型和功能的变化 。

为了探究巨噬细胞对椎间盘（ IVD）微环境早期反应的潜在机制，研究人员比较了尾椎间盘炎症细胞的分泌物与对照组细胞分泌物对巨噬细胞迁移与活化的影响。实验结果显示，炎症细胞分泌物显著增强了巨噬细胞的迁移能力（图8C），其中未活化巨噬细胞（M0）和抗炎型巨噬细胞（M2）的迁移数量显著增加。此外，炎症细胞分泌物还诱导了巨噬细胞的促炎激活，表现为CD38阳性细胞比例显著升高，而CD206阳性细胞比例显著降低（图8D、8E）。进一步的分析表明，炎症细胞分泌的IL-1β、IL-6和IFN-γ等炎症因子在巨噬细胞迁移与极化中起到了重要作用（图8B）。这些发现表明，尾椎间盘的炎症微环境通过分泌炎症介质，不仅增强了巨噬细胞的迁移能力，还推动其向促炎表型的极化（图8F），从而加剧了炎症反应的扩散。

图 8. 尾部 IKKβCA-CM 增加巨噬细胞向炎症表型迁移和极化 。

最后，为了确定 IKKβ CA尾部静脉注射所诱导的炎性巨噬细胞表型是否可逆，研究人员评估了M2型巨噬细胞对 IKKβ CA小鼠椎间盘退变的影响。结果显示，抗炎巨噬细胞能够通过分泌抗炎因子并调控髓核和纤维环的炎症反应，显著缓解椎间盘的退行性改变（见图9）。

图 9. 与M2分泌物共刺激减轻 IKKβCA-CM 介导的巨噬细胞炎症反应 。

结论：

本研究揭示了 NF-κB 在椎间盘退变过程中的重要作用。通过聚集蛋白（ aggrecan）驱动的诱导型Cre遗传小鼠模型，证明 NF-κB 的持续激活可引发严重的椎间盘结构性退变，并伴随炎症分子和分解酶基因表达的上调。此外，研究显示 NF-κB 的过度激活促进了巨噬细胞的募集与活化，从而进一步加重炎症反应和退变过程。这些发现为治疗椎间盘退变提供了新的思路和潜在靶点，未来可进一步探索 NF-κB 抑制剂在椎间盘退变治疗中的应用前景。

原文链接：

https://doi.org/10.1126/sciadv.adj3194