实验时间 | cDNA文库构建的实验详细步骤

cDNA 文库构建可以：

（1）用于分离全长基因进而开展基因功能研究；

（2）筛选目的基因并直接用于表达；

（3）提供构建分子标记连锁图谱的所用探针。

cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的 cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。

一、Superscript II—RT 合成第一链

1.  在一 RNase-free 的 0.2 ml PCR 管中加入 x ul mRNA(大约 500 ng) 、1 ul Xho I Primer(1.4 ug/ul)、

(5’GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT…3’)、11-x ul RNase-free water）

说明：大于 500 ng mRNA 分 n 管 (500 ng/tube) 合成第一链，第一链合成完毕后将 n 管合成一管进行第二链合成。

2.  混匀后，70℃ 反应 10 分钟。

3.  反应完成后，立刻将反应体系置于冰上 5 min。

4.  稍微离心一下，顺序加入以下试剂：

（1）4 ul 5×firststrand buffer

（2）2 ul 0.1 M DTT

（3）1 ul 10 mM dNTP(自己配制)

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