抗体在细菌感染中的应用最早可以追溯到19世纪末，德国生理学家Emil von Behring首次利用免疫动物获得血清成功治疗了感染白喉棒状杆菌的患者。然而，由于异源血清治疗引起的副作用，例如传播血源性病原体，过敏反应和免疫反应，血清疗法在20世纪30年代逐渐被高效的广谱抗生素取代。即使如此，因为抗体具有中和细菌毒素和病毒的独特性质, 基于抗体的疗法仍然保留了一部分应用空间。

在广泛使用抗生素半个世纪以后，几乎所有类别抗生素的耐药性菌株不断被发现。耐药性现象在ESKAPE （（ Enterococcus faecium （屎肠球菌）, Staphylococcus aureus （金黄色葡萄球菌）, Klebsiella pneumonia （肺炎克雷伯氏菌）, Acinetobacter baumannii （鲍氏不动杆菌）, Pseudomonas aeruginosa （绿脓杆菌）, Enterobacter spp.（肠杆菌属））中尤为严重。在美国，每年估计有8万人感染耐甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌（MRSA），其中死亡1.1万例。而美国每年为耐药菌治疗的健康支出高达200亿美元，并且因劳动力丧失造成额外300亿损失。此外，临床分离出的MRSA对糖肽，达托霉素和恶唑烷酮类抗生素的敏感性也有所降低。与之相对的是自20世纪90年代之后已没有全新类型的抗生素出现。因此，开发抗细菌感染的替代疗法，例如基于抗体的治疗，成为目前的迫切需要。本文将分为上下两篇，分别以革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性的绿脓杆菌为代表，从靶点选择和现代抗体工程技术的角度，简要综述抗细菌感染的治疗性抗体的研究进展。

治疗性抗体在细菌感染中的研究进展—金黄色葡萄球菌篇

张扬 上海科技大学

金黄色葡萄球菌是一种圆形的兼性厌氧菌，通过各种复杂的机制建立感染。金黄色葡萄球菌产生细胞膜相关蛋白、糖聚合物以及一系列毒素，介导细菌的粘附，促使宿主细胞裂解，干扰抗体功能，抑制补体激活通路并侵染吞噬细胞。针对各种毒力相关分子的抗体和疫苗正在积极开发中（表1）。

表1. 抗金黄色葡萄球菌抗体和疫苗在临床试验中的进展

CP5/8: serotype 5/8 capsular polysaccharides; ClfA: clumping factor A; PNAG: poly-N-acetyl glucosamine; SdrG: serine–aspartate repeat-containing protein G; SEB: Staphylococcal enterotoxin serotype B; IsdB: Iron-regulated surface determinant protein B; MntC: manganese transport protein C; HlaH35L: α-Hemolysin H35L; EsxAB: ess extracellular A/B; FhuD2: ferric hydroxamate-binding lipoprotein; Csa1A: conserved staphylococcal antigen 1A;

金黄色葡萄球菌可以产生一系列超抗原（Superantigen，SAg），包括葡萄球菌外毒素，肠毒素和毒性休克综合征毒素1（Toxic shock syndrome toxin 1, TSST-1）。这些毒素极具刺激性，可引发食物中毒，中毒性休克综合征，急性肺部疾病和自身免疫性疾病。

葡萄球菌肠毒素B（Staphylococcal enterotoxin B, SEB）被美国疾病控制和预防中心（CDC）归类为B类管制病原，因为它具有强毒性并可能被用作生物武器。在一项小鼠感染模型研究中，一种高亲和力SEB特异性小鼠单抗20B1，显著增加感染引起的败血症小鼠的存活率， 降低其促炎细胞因子水平并抑制T细胞增殖。值得注意的是，他们还证明将IgG1转换为IgG2a，并不改变抗原亲和力，显著提高了败血症小鼠的保护能力。

Tilahun及其同事研究了联合使用靶向SEB不同表位的单抗，以及组合使用单抗和抗生素的策略。两者均在金黄色葡萄球菌感染小鼠模型中显示出协同保护效应。

TSST-1是一种22kDa的水溶性单体蛋白，其N-末端结构域与APC上的MHC-II结合，C-末端结构域涉及TCR-Vβ相互作用。在近期一项研究中，研究者通过噬菌体展示技术从合成人单链抗体（scFv）文库中筛选出了针对重组TSST-1的scFv。结果证明这些scFv能够抑制TSST-1介导的T细胞活化和促炎细胞因子产生。

金黄色葡萄球菌可以释放多种细胞溶解毒素，其中研究较多的是穿孔性α-溶血素（Hla，α-毒素）。Hla单体在宿主细胞膜上组装成七聚体并形成直径约1-3nm的孔洞，激活下游细胞信号通路并导致细胞裂解。

由于Hla在金黄色葡萄球菌发病机制中的关键作用，针对Hla的治疗性单抗正在积极开发中。在金黄色葡萄球菌皮肤坏死小鼠模型中，联合使用靶向Hla单抗MEDI4893 ^* 和一线抗生素，表现出保护作用的增强，包括组织损伤减少和愈合加速。

现代抗体工程技术为开发难治的金黄色葡萄球菌感染抗体提供了新思路。通过突变MEDI4893 ^* 中三个氨基酸（M252Y / S254T / T256E），改造后的MEDI4893显示半衰期延长2-4倍而分布特性不受影响。目前，已经完成MEDI4893在健康成年受试者中的安全性、耐受性和药代动力学I期临床试验。

细菌荚膜是位于革兰氏阳性和阴性菌细胞壁外部的多糖层。荚膜参与细菌的粘附，抵抗宿主免疫攻击并介导毒性因子的释放。金黄色葡萄球菌荚膜可以通过干扰调理机制降低细胞吞噬作用。

临床分离的金黄色葡萄球菌株中，血清型5（Serotype 5, CP5）和血清型8（Serotype 8, CP8）荚膜多糖占总分离株的75-80％。Park等人开发了识别CP5和CP8共有表位的血清。体外实验证实了其交叉反应性，研究结果还表明该血清可以促进CP5和CP8阳性金黄色葡萄球菌的细胞吞噬杀伤作用。由于同一抗原在菌株之间存在差异的现象十分普遍，因此识别保守区域的广谱抗体更具开发价值。

粘附于宿主组织对于大多数细菌建立感染至关重要。细菌表面识别粘合基质分子（Microbial surface components recognizing adhesive matrix molecule, MSCRAMM），如ClfA，在此过程中起着至关重要的作用。ClfA是一种纤维蛋白原结合蛋白，参与细菌建立早期感染，脓肿形成过程，抑制宿主细胞吞噬作用并且协助细菌在宿主体内长期生存。

Tefibazumab，一种人源化的抗ClfA单抗，表现出对ClfA的高亲和力和特异性。体外研究表明，Tefibazumab可以抑制ClfA的纤维蛋白原结合能力，并在鼠败血症和兔感染性心内膜炎模型中有效地减轻了MRSA感染。 Tefibazumab的安全性和药代动力学特征在II期临床试验中进行了评估 。然而可惜的是，治疗组与安慰剂组之间未发现显著疗效差异。结构学分析表明，虽然Tefibazumab与ClfA亲和力较高，且其表位与纤维蛋白原重叠，但是Tefibazumab抑制纤维蛋白原与ClfA结合的IC50值一般，这可能部分解释了不尽人意的临床结果。从该研究中可以看出，新型抗体的开发需要综合考虑各种因素，看似细小的性质被忽略可能导致功亏一篑。

大多数革兰氏阳性菌产生磷壁酸（Teichoic acid, TA）以帮助其在恶劣条件下存活。TA与肽聚糖或细胞质膜共价连接，分别称为壁磷壁酸（Wall teichoic acid, WTA）和脂磷壁酸。TA已被证明参与宿主细胞粘附，补体激活，细胞因子诱导等过程。

由于LTA的结构在一些临床分离菌株（包括肠球菌，葡萄球菌和链球菌）中高度保守，因此LTA被认为是疫苗和治疗性抗体开发的十分有前景的靶点。在近期一项报道中，Weidenmaier等测试了针对粪肠球菌LTA的抗体与其他革兰氏阳性菌（包括金黄色葡萄球菌）的交叉反应活性。体外数据显示，该抗体也能够与金黄色葡萄球菌LTA结合。值得注意的是，抗体在不同金黄色葡萄球菌株中显示出60-90％的调理吞噬杀伤活性，并且在小鼠腹膜炎模型中显示出极大的抗MRSA感染的保护作用。

摄取养分是几乎所有生命形式中最基本和最重要的过程之一。脊椎动物已经进化出了强大的抗感染策略，称为营养免疫，即通过储存必需营养元素来限制入侵病原菌的增殖。营养免疫中最典型的例子之一是过渡金属离子螯合，即一些重要金属离子被宿主金属结合蛋白储存起来以防止被入侵者利用。在与宿主防御系统斗争的漫长过程中，细菌也进化出对应机制以维持细菌细胞内金属离子的平衡。因此，这些机制成为治疗性抗体开发的潜在靶点。例如，由于Mn ²⁺ 对活性氧（ROS）的解毒是必需的，研究者们筛选出Fab以抑制Mn ²⁺ 的吸收途径。Fab通过与ATP结合匣式转运系统（ATP-binding cassette, ABC）的金属结合蛋白（MntC）结合，从而阻断Mn ²⁺ 的转运。体外测定显示，Fab将金黄色葡萄球菌对ROS的敏感性提高了十倍以上。

开发针对膜蛋白的抗体在技术上是一个挑战。然而，由于膜蛋白在各种关键细胞过程中的重要作用，例如营养吸收，离子平衡，信号转导，耐药性，以及细胞壁和膜完整性的维持等，膜蛋白可能代表了一类重要靶点。值得注意的是，由于较厚的细胞壁屏障的存在，全长抗体可能难以接触到靶点。因此，其它抗体形式，如Fab或scFv，则更容易渗透到靶点区域。当然，Fc介导的功能，例如抗体介导的调理杀伤作用，将会丧失。

虽然金黄色葡萄球菌通常被认为是细胞外病原菌，但越来越多的证据表明它能够存活在宿主细胞内，甚至是负责细菌清除的吞噬细胞。尽管吞噬细胞，特别是嗜中性粒细胞和巨噬细胞能有效地杀死大部分入侵细菌，但是少数在细胞内存活的细菌可以利用血液循环将宿主细胞作为“特洛伊木马”，促进细菌的体内扩散。同时，细胞内的细菌能有效躲避抗生素和免疫系统攻击。事实上，目前大多数抗生素对细胞内金黄色葡萄球菌的杀伤效率低下。这也许部分地解释了抗生素治疗效果差和临床试验中高频率的复发现象。

基于这些发现，专门针对细胞内病原菌的治疗策略或许能促进治疗效果。与已经成功应用于癌症治疗的抗体-小分子药物偶联物（Antibody-drug conjugate, ADC）类似，Lehar及其同事在2015年首次提出和评估了抗体-抗生素偶联物（AAC）。AAC由3部分组成：针对细菌抗原的抗体，高效杀菌的抗生素，以及将抗生素共价连接于抗体的连接物。因为共价连接的抗生素是前体药，AAC本身没有抗菌活性。然而，当游离AAC标记的细菌被宿主细胞吞噬后，抗生素可通过宿主蛋白酶的切割以其活性形式释放。因此，AAC把细菌作为“特洛伊木马”，将抗生素递送至细胞质，从而发挥其细胞内的抗菌作用。小鼠模型研究结果表明，在静脉感染若干小时后开始治疗，AAC可以有效地限制细胞内金黄色葡萄球菌的生长。相比之下，万古霉素对细胞内病原菌疗效甚微。此外，AAC还成功地在静脉感染模型中限制了金黄色葡萄球菌的脑部转移。

与传统抗生素相比，抗体具备一些独特优势，包括特异性高，半衰期长，介导细胞吞噬杀伤作用等。目前抗金黄色葡萄球菌抗体的研究在实验室水平已取得了一些令人振奋的结果。然而，从靶点角度看，目前抗体不具备穿膜特性，它们均针对胞外靶点，包括分泌的毒力因子，细胞壁成分和细胞膜成分，这些靶点大多是细菌繁殖非必需基因，虽然能降低病原菌毒力，但难以有效抑制细菌生存。相比之下，小分子抗生素不仅可以作用于细胞壁成分，而且可以靶向细胞内靶点，如氯霉素作用于核糖体50S亚基，从而抑制蛋白合成。再考虑到细菌外部有层厚的细胞壁，导致大分子的抗体甚至不易渗透到一些靶点区域，例如细胞膜上的重要靶点，如通道蛋白。综合来看，目前抗细菌感染抗体的开发仍面临诸多局限。

开辟新的有价值靶点仍是一个重要研究方向。除了与细菌生存和毒力相关基因以外，与耐药性相关基因也可以成为一类重要靶点，例如抗生素外排泵。这时抗体和抗生素联用或许能起到事半功倍的效果。

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