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结合TP-Mg纳米颗粒的3D打印多功能仿生骨支架用于感染性骨缺损修复

BCML速递 · 公众号 · · 2024-08-14 22:00

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感染性骨缺损是一种由微生物感染引起的骨损伤或缺损，通常是由于严重污染的骨折或血源性感染所致，由于细菌耐药性增加和缺乏理想的骨移植物，感染性骨缺损是骨缺损治疗中最具挑战性的问题之一。

受临床骨水泥填充治疗的启发，四川大学钱志勇、刘显教授团队以聚乙烯醇（ PVA ）、 α- 磷酸三钙（ α-TCP ）、 β- 磷酸三钙（ β-TCP ）和明胶为生物墨水，负载茶多酚 - 镁（ TP-Mg ）纳米颗粒构建了仿生支架（ α/β-TCP@TP-Mg ）。该支架集抗炎、抗菌、骨诱导于一体，对金黄色葡萄球菌（ S.aureus ）具有显著抑制作用，并可促进巨噬细胞从 M1 促炎表型向 M2 抗炎表型的转变。此外，基于 Mg ²⁺ 和 Ca ²⁺ 的协同作用，该复合支架还表现出优异的骨诱导能力，在调节早期感染微环境的同时，促进晚期骨再生愈合，在治疗感染性骨缺损方面具有广阔的应用前景。

首先，研究者通过一步法使金属镁（ Mg ²⁺ ）与茶多酚（TP）在碱性环境中发生螯合作用，形成稳定的TP-Mg簇合物，该纳米级团簇均匀地分布在红棕色溶液中，带有较强的负电荷（图2A-C）。β-TCP具有独特的水化特性，水解后可形成缺钙羟基磷灰石（CDHA），使骨水泥在瓶底固化，β-TCP含量的增加可明显缩短复合凝胶的固化时间（图2D）。考虑到明胶的热敏性和α-TCP的固化性能，研究者探索了适应低温3D打印过程的参数。在最优的参数下打印的水凝胶表现出良好的可注射性（图2E），打印墨水通过降低剪切应变可以恢复凝胶状态，由于α-TCP的水化固化减少了应力引起的剪切减少，从而导致挤出墨水更高的成形性和堆叠支架时更协调的机械性能（图2G）。

紧接着，研究人员对 α/β-TCP 支架进行了表征。 TP-Mg 成功负载到 α/β-TCP 支架后，支架呈现棕黄色，具有骨组织向内生长的典型宏观大孔结构和促进血管向内生长和非骨组织生长的微观尺度孔结构（图 3B ）。 X 射线衍射（ XRD ）进一步证实了 β-TCP 向 CDHA 的转变（图 3C ）。 FTIR 中官能团的变化证明了支架中 TP-Mg 的存在（图 3D ）。 CDHA 的结晶结构使孔隙率略有增加（图 3C, E ）。原子力显微镜（ AFM ）可观察到 α/β-TCP 的支架表面显著粗糙于 β-TCP 支架， β-TCP 含量的增加提高了支架的亲水性和吸水率（图 3F-H ）。

然后，研究人员对支架的机械性能进行了评价。压缩实验表明低温成型的陶瓷支架比高温烧结的陶瓷支架具有更好的机械性能（图 4A, B ）。在人体骨组织的潮湿模拟环境中，仿生骨组织支架仍具有接近松质骨的最低压缩模量，且其机械性能通过 β-TCP 的固化作用而增强（图 4C, D ）。支架还具有良好的药物缓释性和矿化作用（图 4E, F ）。此外，由于生物陶瓷本身的降解速度较慢，早期主要以胶原蛋白降解为主，支架的降解呈现先慢后快的现象。胶原蛋白降解导致降解环境 pH 略有下降，而随着支架中的无机盐降解并持续释放 OH ^- ，降解环境上升至中性降解水平（图 4G, H ）。

为了获得优异的生物相容性并保持最优的药物功效浓度，研究者构建了负载不同浓度（ 10 、 50 μM ） TP-Mg 纳米颗粒的 30α/β-TCP 支架中以观察其效果。细胞活 / 死染色、 CCK-8 测定及细胞活力分析结果表明，高浓度 TP-Mg 纳米颗粒具有一定程度的细胞毒性和抑制细胞增殖的作用。 SEM 图像可观察到，与其他组相比，大量骨髓间充质干细胞（ BMSC ）粘附在 30α/β-TCP@10TP-Mg 支架上。以上结果表明 TP-TCP 可改善材料的表面粗糙度，为细胞粘附提供更好的平台，且 TP-Mg 纳米颗粒在合适的浓度下可促进细胞增殖（图 5 ）。

随后，研究者通过 ALP 染色、茜素红染色和 qRT-PCR 进一步定性和定量评估了复合材料的成骨分化能力。结果表明， β-TCP 和 30α/β-TCP 由于其足够的无机盐含量而表现出一定的成骨作用，而在安全浓度下， 30α/β-TCP@10TP-Mg 可以通过早期释放 Mg ²⁺ 来改善和促进成骨基因的表达（图 6 ）。

为了进一步探索支架在严重炎症环境中促进骨修复的能力，研究者使用脂多糖（ LPS ）处理 RAW264.7 细胞诱导巨噬细胞 M1 极化来模拟炎症环境。理想情况下，支架释放的 TP-Mg 调节促炎 M1 型巨噬细胞向抗炎 M2 型极化，经过有利的免疫调节作用后增强骨再生，此时巨噬细胞的细胞形态转变为细长型（图 7A, B ）。免疫荧光和半定量结果显示 30α/β-TCP@10TP-Mg 明显增强了细胞自 M1 向 M2 型极化的能力，证明了支架的抗炎作用（图 7C ， D ）。蛋白质印迹分析发现经 30α/β-TCP@10TP-Mg 组处理后， INOS 表达下调，磷酸酶 -1 （ ARG-1 ）表达上调，证实了支架的免疫调节能力（图 7F ）。

然后，研究人员研究了支架的抗菌作用。细菌的活 / 死染色图像表明 30α/β-TCP@10TP-Mg 组和 30α/β-TCP@50TP-Mg 组对细菌具有显著的抑制作用。细菌形态的 SEM 观察显示，与支架共培养后， 30α/β-TCP 支架通过破坏细菌膜来实现抗菌作用（图 8A, B ）。为了进一步研究支架对细菌的抑制机制，通过测量培养后的 OD 600 和 ROS 水平来检查细菌增殖，结果表明，与 30α/β-TCP@10TP-Mg 和 30α/β-TCP@50TP-Mg 共培养后，金黄色葡萄球菌的生长受到抑制，同时 ROS 产生显著增加，这可能是由于 TP-Mg 引起细菌内氧化应激增加，从而介导代谢功能障碍并导致细胞死亡（图 8D, E ）。图 8 C 说明 TP-Mg 对细菌的抑制作用。根据以上结果可知，尽管 30α/β-TCP@10TP-Mg 组释放的 TP-Mg 浓度较低，但其仍表现出与较高浓度的 30α/β-TCP@50TP-Mg 组相似的抗菌效果，证明在安全的细胞毒性浓度下具有良好的抗菌效果，使其能够避免在感染性骨缺损的临床治疗中注射大剂量抗生素的副作用。

为了进一步评估 α/β-TCP @TP-Mg 支架修复感染性骨缺损的能力，研究人员在 SD 大鼠中建立了感染性颅骨缺损模型。在支架填充后的第三天，添加 TP-Mg 组的颅骨周围肌纤维组织中的细菌菌落显著减少， Micro-CT 清楚地显示了部分降解的陶瓷支架和周围新形成的骨组织。研究者又进一步分析骨再生的定量效果，其中， α/β-TCP@10TP-Mg 组显示出更厚和更成熟的新骨组织，表明该组支架对成骨有良好的促进作用（图 9 ）。

最后，研究者通过苏木素 - 伊红（ H&E ）染色和 Masson 染色对骨再生过程进行了更详细的评价。结果表明， TCP 基复合陶瓷支架由于其矿化行为而具有一定的骨诱导性， TP-Mg 纳米颗粒的加入在早期抗炎和抗菌作用以及后期成骨作用中发挥了持续作用，这也证实了早期具有抗菌能力可以促进新骨生长，同时修复感染性缺损（图 10 ）。

综上所述，该研究从临床角度讨论了感染性骨缺损的特点和当前的问题。使用低温 3D 打印制备了仿生骨陶瓷支架，为骨缺损提供足够的机械强度和骨传导性能。通过负载 TP 和 Mg 自组装纳米颗粒构建了具有抗菌、抗菌和骨诱导性能的纳米复合陶瓷支架。在大鼠感染性骨缺损模型中也显示出良好的修复效果。这一新型医疗产品有望成为感染性骨缺损的精确治疗方法，无需二次手术或过度使用抗生素，从而为探索感染性骨缺损的治疗提供了更丰富的研究内容。

该研究由四川大学华西医院钱志勇、刘显教授团队完成，并于 2024 年 5 月 28 日在线发表于 Small 。

论文信息： Xulin Hu, Jiao Chen, Shuhao Yang, Zhen Zhang, Haoming Wu, Jian He, Leilei Qin, Jianfei Cao, Chengdong Xiong, Kainan Li, Xian Liu,* and Zhiyong Qian*. 3D Printed Multifunctional Biomimetic Bone Scaffold Combined with TP-Mg Nanoparticles for the Infectious Bone Defects Repair. Small 2024, 2403681.

供稿：何辉

审校：马进进

编辑：陆凯