转录组测序常见问题整理

注释到的基因数与研究物种及选用的数据库有关，现有数据库中关于该物种及其相近物种的注释信息越全，则注释率也会越高。

NR数据库作为NCBI主要数据库之一，库容较大，能注释到较多的基因，但 注释到的基因 中未验证的信息也较多，且很多基因功能描述模糊，会影响我们对基因功能的辨识。因此，结合其他数据库注释结果综合考量更为妥当。验证实验需结合具体的生物学意义。

差异基因较多时，可通过功能注释缩小筛选范围，且挑选差异倍数大、表达量较高的基因来验证，成功率会较高。

差异分析是基于整体来做，要用全部read count进行差异分析。

若提取部分基因做分析，会破坏数据的整体性，如 reads分布特征 、测序深度等，所以不建议提取部分基因做差异分析。

差异基因的筛选基于统计学，不能仅通过某个基因在两个样本中表达量数值的大小，判断差异表达是否显著。

差异显著情况可通过矫正后的p-value来看，矫正后的p-value越小，差异越显著。

也可结合|log2Foldchange|值来判断差异的大小，|log2Foldchange|越大，差异倍数越大。

• FPKM

  与RPKM极为相近。区别仅在于 Fragments 与 Reads 。

  RPKM主要针对早期的 单端 （ SE ）测序，FPKM是在 双端 （ PE ）测序上对RPKM的校正。

  Reads是测序数据中的每一条Reads，Fragments是每一段用于测序的核酸片段（建库时打断获得）。

• RPKM

  为每百万Reads中，每个基因以一千个碱基为单位，比对上的Reads数。

  计算公式：RPKM=(1000000*C)/(N*L/1000)

  （ C 为比对到gene A的reads数，N为比对到所有gene的总reads数，L为gene A的碱基数。 ）

  RPKM法能消除基因长度和测序量差异对基因表达量计算的影响，计算得到的基因表达量，可直接用于比较不同样品间的基因表达差异。

• TPM