DOI:
10.1021/acs.jmedchem.4c02929
Ras 激活突变是癌症最普遍的驱动因素之一，尽管当前 FDA 已经 批准了两款靶向 KRAS G12C 失活状态的不可逆共价抑制剂，然而临床需求仍然远远未有获得满足。
前日（Mar. 31），
CRUK苏格兰研究所
联合
诺华
在
J. Med. Chem.
上报道了一系列新型可逆抑制剂，它们具有nM 级亲和力，结合在放大版 Switch I/II 口袋中。
神奇的是，通过稍微的化学型的改变，就可以实现优先结合
非活性状态
、或
活性状态
、或以相似亲和力结合
OFF/ON两种状态
的突变体！
活性化合物可有效抑制野生型、和多种具有具有nM 级效力的致癌 KRAS 突变体的相互作用。其中的一个系列的分子表现出抑制 RAS-RAF 相互作用的细胞活性，以及下游蛋白ERK 磷酸化的降低，这表明可以从这个新的口袋中获得有效的多变体RAS抑制剂。
RAS 基因突变是积累人类癌症的主要驱动因素，在人体内，有 3 大 RAS 基因编码 4 种不同的 RAS亚型，分别是：HRAS、NRAS、以及两个 KRAS 剪接变体（KRAS4A、KRAS4B）。
RAS 蛋白属于GTP 酶家族，在正常细胞中激活分子开关，在失活状态的 GDP 结合状态和活性的 GTP 结合状态之间循环，并伴随有上游、下游效应蛋白，控制细胞生长、凋亡、存活和分化。
然而，RAS突变主要发生在G12、G13、Q61 密码子，并扰乱正常的细胞进程，导致更高水平的 GTP 结合状态的 RAS，致使持续信号传导并触发潜在的肿瘤发生、发展。
RAS蛋白一度是“不可成药”靶点代名词，直到最近获得了些许进展，特别是 FDA 批准了两款KRAS G12C突变体不可逆共价抑制剂 AMG-510、MRTX849，如下图，自此踹开了KRAS 靶向治疗的大门。
然而，已获批的两款药物仅针对单一的 G12C 突变，非主要 KRAS 突变体，且依赖肿瘤细胞的非活性状态（GDP结合态），存在耐药性、适用范围窄等问题。
针对临床需求和当前疗法的局限性，目前也有其它几种共价 G12C 抑制剂正处在临床前开发阶段，以克服 G12C 抑制剂的耐药机制。
除了共价靶向疗法，研究人员也提出了其它的创新疗法，包括：
1、联合用药治疗，
如联合 SHP2、EGFR、或 MEK 抑制剂；
2、降解剂和分子胶水
；如上图中RMC-7977，是一种类分子胶水的可逆的三元复合物多突变体 RAS 抑制剂；
3、非共价泛 KRAS 抑制剂
，如上图中泛-KRAS抑制剂 BI-2865;
目前已获得研究数据表明，多变体或泛-RAS抑制剂可能是治疗多种 RAS 依赖性癌症的一个有希望的选择，同时，对突变选择方法的许多其它耐药机制不那么敏感。
目前批准的KRAS G12C 不可逆药物结合在 Switch-II 下方的一个
诱导的变构口袋（switch-II-P）
，且仅以非活性 GDP 结合状态存在，因此，该策略依赖于两个核苷酸结合状态之间的活性循环。
当前，也有一些候选药物通过同时结合 GDP、和 GTP 加载形式，或者通过改善靶标结合动力学来克服以上挑战，但迄今为止尚未有一种药物获批用于患者。
本文研究人员，结合基于结构的药物设计，发现了一系列可逆小分子抑制剂，通过结合RAS 蛋白的 Switch I-II 口袋扩增区域，实现对多种突变体（如G12D、G13D、Q61K）和不同结合状态（GDP、GTP）的广谱抑制。
故事的开始起源于利用 SPR 技术和内部收集的 656 个化合物片段对
KRasG12D·GTPγS 的筛选。通过 SPR 浓度响应和核磁共振交叉验证，确定了 5 个初始 Hits，如下图。
研究人员同时也利用商业资源和化学合成两种手段，获得了与文献报道 Hits结构近似的化合物，并进行测试，最终发现了化学位移扰动（CSP）比文献报道的Hit 显著的
喹啉磺酰胺片段化合物 1
，如上图C、D。
确定了片段化合物 1 后，研究人员探究了几个单点变化，如下表。其中，化合物 4，获得了显著提高。
然而，研究人员通过杂交 片段 1、 和5，获得化合物 6，如下图，克服了荧光性问题。
在体外 ADME 对比分析中，如下表，化合物 6 相比于喹啉磺酰胺片段，具有相似的亲和力，近似的配体效率（LE），且具有良好的渗透性、中等的动力学溶解度、以及在小鼠肝微粒体中稳定，同时没有荧光性问题。因此，片段 6 进行进一步的探究。
如下表，研究人员首先探索了片段 6 中 6-氯苯并噻唑杂芳香基序的苯基部分以及苯基磺酰胺的苯基部分的取代基，
引入氢键供体
。
可以看出，通过氢键供体片段的引入，极大地改善了结合亲和力，其中
化合物 12
最为显著，其对失活状态的NMR 结合亲和力增加了 10 倍，生化效力增加了 3 倍。
如下图，通过对
化合物 8、9、11
的结合晶体结构研究，发现了苯环上的氢键供体取代基在疏水口袋中与残基的关键相互作用。
通过对
化合物 12
的苯并噻唑芳香杂环的
N
烷基化，进一步钢化杂芳香结构，发现钢化后的
化合物 13
进一步增加了对 GDP 负载态的结合亲和力，并增加了对 SOS1 介导的核苷酸交换的抑制（NEA IC
50
），如下表，甚至达到了 NMR 测定的KD下限。
如上表，为了靶向 Asp38，研究人员合成了
化合物 13
的
烷基化类似物 14
。从下图中的晶体结构研究中可知，
氨基
N
与羧基之间的距离还在标准氢键之外
！
此外，从上图A中可以看出，
苯并噻唑基和酰胺乙醇基相互指向，形成近似的“U”型构象，这预示着在这里有潜力考虑“大环化”的策略，进一步提高效力。
因此，研究人员通过在二级酰胺与苯并噻唑
N
之间通过 5 个碳链，约束
化合物14
的生物活性构象，如上图和下表，大环化后的
化合物 15
，亲和力显著提高。
从上图 B 中的晶体结构中表明，虽然哌啶基序取向与 Asp38 的侧链，然而氨基
N
与羧基之间的距离在标准氢键之外，而考虑到该氨基位点与 Asp38 有潜力更有效地相互作用，因此，研究人员合成了一系列一级、二级、三级环胺和双环胺类似物，以及不同长度的环化连接器（4-5 个碳），
旨在靶向该Asp38 残基
，如下表。
在针对大环化合物 15的结合晶体结构的进一步研究发现，在 GTP 结合KRAS的开关构象将 Glu37 推向了结合位点，如下图，这使其无法与Ala59 氢键结合，部分阻断了该位点。
对于这些与GTP 结合的KRAS 构象结合的大环化合物，它们需要将 Glu37 推向一边，从而产生结合的能量惩罚。此外，Asp38 也表现出广泛的侧链灵活性。
选择一些大环化合物进行体外 ADME 的初步测定，如下表，总的说来，获得了良好的动力学溶解度；然而，
低渗透性加上高外排比，以及小鼠微粒体和肝细胞中高的内在清除率表明，这些化合物可能受到低外周暴露的影响
。
研究人员还选择一些大环化合物进行细胞效力测试，如下图。化合物 27、28 显示出对 WT/G12C/G12D/ KRAS-Raf 和 H/NRAS WT-cRaf 相互作用的中度浓度依赖性抑制。总之，验证了这些大环化合物可以靶向抑制细胞，使其存活率下降。
研究人员在文献中以及自身采用动力学模拟发现，如下图A，大环配体的磺酰胺2-羟基位置可以作为生长模块，使配体向 Gly12 残基突变位点和核苷酸结合位点生长。
因此，可以基于此设计与残基 12 位点的特异性相互作用，同时也可研究该基序部分羟基的可替代选择。
因此，研究人员围绕此前获得效力最高的化合物 21 在芳基部分进行改造，选择2-氨基吡啶来作为芳基酚的扩展连接，如此获得了大环类似物29，如下表。
然而，其效力仅为中等，不过研究人员获得了其结合晶体结构，供进一步的研究，如下图。
在进一步的研究中发现
，该化合物竟然在Switch I 和 Switch II 之间产生了一个小的口袋，这是以前从来未被报道过的
！
因此，研究人员欣喜之余，对该“Interswitch”进行了探索，如下表，并选择了
化合物 16
中使用的更容易合成的顺环己胺，它在微粒体稳定性、效价、溶解度方面也都表现出良好的平衡。
研究人员基于
2-氨基吡啶基
序进行了几种二级胺和叔胺的探索。
吡咯烷取代的2-氨基吡啶大环化合物 31 针对两种核苷酸装载状态具有等效的亲和力；其结晶体结构如下图，两个开关区域部分无序，配体吡咯烷向Glu63 提供氢键。
哌嗪基序衍生的大环 32 在Glu37 位置形成氢键，如下图。
将化合物继续深入 “interswitch”区得到顺环己基衍生大环 33，具有于KRAS·GMPPNP之间次微摩尔亲和力（SPR测定）。继续扩展，获得34、35，具有个位μM、或次μM亲和力。
大环 34 晶体结构仍是部分构象紊乱，但Glu37、Asp38稳定为单一构象，如下图。
通过联双环胺，获得更加钢化的大环36，其表现出 nM 亲和力，并对GMPPNP结合状态具有高度的选择性，其晶体结构如下图，显示与Asp 侧链发生双齿相互作用。
此外，该化合物与核苷酸的γ-磷酸（GMMPNP）形成水介导的氢键，也可能有助于选择性。
然而，尽管大环36表现出了高亲和力，但是由于高极性表面积可能会阻碍细胞膜的穿透。
总体上看，基于该 “interswitch” 区域的化合物改造，在一系列RAS突变体中保持了亲和力和生化活性。测试的化合物对G12D、G13D、G12V具有中等选择性，而Q61K突变体在该实验中表现出稍微低的敏感性。
本项研究通过
结构导向设计
和
多状态靶向策略
，成功开发出首个可逆性多变异Ras抑制剂系列。尽管仍需优化药代性质，但这一突破为克服Ras“不可成药”难题提供了全新工具，未来有望通过进一步优化或新型给药技术，推动临床转化。
首先，
大环化策略
，通过晶体结构研究，结合亲和力和效力结果，找到合适的位置构建大环结构，使得效力和亲和力获得了显著得提高。
其次，
模块化设计思路
，如以2-氨基吡啶代替酚羟基，并通过模板生长，在维持原有相互作用的同时，从结构观察上逐级改造结构，获取新的相互作用，以提高效力或选择性，或改善代谢稳定。
再次，
联合用药启示
，本研究发现了一系列高效的活性状态抑制剂、非活性状态抑制剂、以及中等效果的两种状态抑制剂；活性可以利用高效活性状态抑制剂与现有的非活性状态 G12C 抑制剂联用，覆盖更广泛突变谱，并延缓耐药。
此外，
新靶点作用口袋启示
，本研究在晶体结构研究中发现了一种“interswitch”结合模式，为开发双功能抑制剂（即同时靶向Switch I-II 和Switch II-P口袋）提供了基础。
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