实用干货 | 转录组测序结果常见问题问答

基迪奥生物 · 公众号 · · 2024-09-18 18:04

正文

为何我关注的基因未出现在结果文件中？

基因未出现在结果文件中可能由多种因素导致：

检测平台差异：

目前常见的mRNA基础测序手段主要有基于PolyA捕获的二代高通量测序和基因芯片测序。基于PolyA捕获的二代高通量测序则要求目的mRNA要有PolyA的尾巴;基因芯片测序利用已知序列的cDNA探针来对靶基因进行检测，如果我们的基因不在探针的范围内，检测结果中也不会出现该基因。各个检测平台都有自己的优势和短处，如果想准确达到实验预期，选择正确的测序平台和测序方法是当务之急。

基迪奥针对全转录组分析提供了独具一格的个性化分析方案，仅需构建两种文库(小RNA文库和去核糖体的链特异性文库)就可以同时分析4种RNA(miRNA，lncRNA，mRNA，circRNA)的信息。节约成本的同时，也节省了样本量,另一方面使用同一批次样本提高了研究结果可比性。

基因本身差异：

基因丰度低： 所有的检测手段的结果都涉及到灵敏度，如果基因的丰度低于检测的灵敏度阈值，那它就不会被检测到。

样本质量问题： 如果样本在采集、处理和保存过程中出现问题，也可能会影响检测的结果。例如，样本的降解或者污染都可能导致某些基因信号的丢失。

数据分析和解释： 如果在生信分析过程中使用的基因注释文件中不包含我们想要的基因，那最后的文件中自然也不会出现我们的目的基因，对于这种情况，我们通常有两种解决办法：1. 在标准流程分析中对转录本进行重构，进行新基因的预测，这样我们就可能得到无注释基因的注释和表达量信息。2. 如果我们已经确定该基因在基因组上的位置，我们可以将位置信息手动添加到注释文件中，完善好注释信息后再进行重新比对，得到表达量信息。

基因表达水平与开关状态，哪个更重要？

细胞基因表达的高低：基因表达高低的主要结果是控制相应产物的数量，对细胞整体的生理状态至关重要。在外界环境变化后，细胞受到损伤时，细胞会调控部分蛋白或者RNA的含量以应对环境胁迫。

细胞基因表达的开关：基因表达开关的主要结果是控制相应产物的有无，对细胞的发生发展至关重要。在细胞分化过程中，特定基因的激活促进细胞向预期方向分化。此时，基因开关决定了细胞命运。

在不同的生物学过程中，这两种调控方式的重要性都不相同。我们需要结合研究背景和研究目的来看待这个问题。通常在研究细胞分化的过程中，基因表达开关可能更为关键；在研究环境胁迫时，基因表达水平的精细调控可能更为重要，因为它涉及到细胞对外界信号的响应和适应。

基因的表达量与蛋白和代谢的产生量同步吗？

基因表达量与蛋白质和代谢物的产生量并不总是同步的。基因表达涉及多个步骤，包括转录（DNA到RNA）、RNA加工、翻译（RNA到蛋白质）以及蛋白质的后续修饰和降解。这些过程中的任何一个环节都可能影响最终蛋白质和代谢物的产生量。

1.转录后调控： 即使基因的转录水平增加，RNA分子可能在加工过程中发生剪接错误，或者在成熟过程中被降解，导致蛋白质表达量不增加。例如，mRNA的稳定性、剪接变异和3'端加工都可能影响最终的蛋白质产量。

2.翻译调控： mRNA的翻译效率可能受到多种因素的影响，包括mRNA的5'端帽子、3'端的多腺苷酸序列、以及mRNA分子上的次级结构。此外，细胞内部的翻译准备工作也会对蛋白质的合成产生影响。

3.蛋白质稳定性和降解： 蛋白质的稳定性差异很大，有些蛋白质很快就会被细胞内的蛋白酶降解，而有些则非常稳定。此外，翻译后修饰（如磷酸化、泛素化）也会影响蛋白质的稳定性和活性。

4.代谢调控： 代谢物的产生不仅受到基因表达的调控，还受到代谢途径中酶活性的调控。有些情况下，代谢物的浓度可能受到反馈抑制或激活，从而影响整个代谢途径的流量。

5.环境因素： 细胞内外环境的变化，如营养物质的可用性、氧化应激、温度变化等，都可能影响基因表达、蛋白质合成和代谢物的产生。

如何理解测序结果中的Gene ID？

我们通常对某个基因的称呼，比如TNF-a之类的名字，是这个基因的功能+编号的缩写。对于很多数据库而言，为了方便记录，他们在自己的系统中赋予了每个基因唯一编号，这样就导致一个基因同时拥有多个ID。

Entrez Gene

NCBI使用纯数字来代表基因，比如下图的1026，NCBI还列出了它的Official Symbol- CDKN1A，也就是我们通常对基因的称呼，同时还列举了一些别名。

数字ID仅代表基因，对于该基因的不同转录本和蛋白异构体，NCBI提供了NM前缀和NP前缀，NR则代表非编码RNA。

Ensembl Stable IDs

Ensembl是一个广泛使用的生物信息学数据库和基因组浏览器，它提供真核生物基因组的注释信息，并且支持比较基因组学、进化、序列变异和转录调控的研究。Ensembl自动注释基因，计算多种比对，预测调节功能，并收集疾病数据。

Ensembl的基因命名遵循一定的规则，例如人类基因的命名以"ENS"开头，后面跟随类型和编号，如"ENSG"代表基因，"ENST"代表转录本。对于其他物种，如小鼠，基因命名以"ENSMUSG"开头代表基因，"ENSMUST"代表转录本。

实用干货 | 转录组测序结果常见问题问答

正文

请到「今天看啥」查看全文