亮点
•膝内翻患者胫骨平台前内侧承受的压力最大
•Zmpste24 表达减少，在过度压力下发生核不稳定性
•Zmpste24 过表达挽救因过度压力引起的软骨细胞衰老
概括
OA 和内翻膝患者处于异常的机械环境中，本研究的目的是研究机械超负荷导致软骨细胞衰老的分子机制以及 Zmpste24 介导的核膜不稳定在内翻膝中的作用。有限元分析表明，在内翻膝骨关节炎患者中，胫骨平台前内侧区域承受的机械应力最大。免疫组织化学显示前内侧区域的 Zmpste24 表达较低，衰老标志物 p21 表达较高。动物实验和细胞拉伸模型也证明了 Zmpste24 与机械诱导的衰老之间存在反比关系。Zmpste24 过表达在体外挽救了软骨退化和衰老通过清除 ROS 来抑制前内侧胫骨平台。总之，在内翻膝关节中，胫骨前内侧平台承受异常压力，Zmpste24 的下调和核膜稳定性可能解释该区域衰老的增加。Zmpste24 和核膜稳定性是治疗由异常排列引起的骨关节炎的潜在靶点。
介绍
骨关节炎 (OA) 是最常见的关节疾病，也是全世界范围内致残、疼痛和社会经济负担的主要原因。其特征是局部软骨磨损、软骨下骨硬化和骨赘形成。1目前有许多有前景的治疗方法，例如针对 IL-1β 2和 TNF-α 的抗体、3富血小板血浆、4干细胞5和成纤维细胞生长因子 18 (FGF18)。6然而，目前尚无可以逆转终末期软骨退化的治疗方法。OA 是一种多因素疾病，其中最突出的因素是衰老和肥胖，1这些与衰老和异常机械状况有关。
膝关节、髋关节是下肢主要承重关节，日常活动中承受较大的接触压应力。7膝关节软骨从关节面向软骨下骨主要分为四个区域8 ：浅层、中层（过渡层）、深层和钙化层。多项研究表明，合理的机械刺激通过下调Mmp1（基质金属蛋白酶基因1）和Mmp13的表达，对软骨细胞代谢有保护作用。9相反，过度的应激会导致软骨细胞分解代谢，加速软骨基质的降解。10，11，12一项前瞻性纵向队列研究显示，内翻和外翻畸形均会增加膝关节 OA 进展的风险。13胫骨高位截骨术（HTO）在临床中广泛应用，并取得了满意的疗效，这表明矫形与骨关节炎之间存在密切的关系。14因此，探索机械超负荷诱发软骨退变的机制，发展非侵入性治疗方法具有重要意义。目前尚无研究报道核膜稳定性在应力诱发软骨退变中的作用。
除了肥胖，细胞衰老也是导致OA的重要因素。15、16、17衰老细胞会向周围微环境分泌有害的促炎分子，如IL-6、IL-1β和Mmps，这被称为衰老相关分泌表型（SASP）。18、19在OA患者的软骨中发现了衰老细胞。15 Jeon等人20研究表明，软骨中衰老细胞的局部清除可缓解OA的进展。在OA的病因学中，衰老和机械超负荷通常被视为独立的因素。近年来，一些研究探讨了它们之间的关系，发现氧化应激21、22泛素连接酶10microRNA23和雌激素受体24都在这种相互作用中发挥作用。然而，Zmpste24介导的核不稳定性在机械超负荷相关的软骨细胞衰老中的作用尚未得到研究。
Zmpste24 是一种锌金属蛋白酶，通过切割蛋白质在层蛋白 A 的成熟过程中发挥重要作用。25层蛋白 A 是核膜的主要成分，其未成熟形式前层蛋白 A 的积累会影响核结构和力学，26随后导致基因组不稳定和 DNA 损伤。27 Zmpste24 基因敲除小鼠表现出明显的过早衰老表型，包括自发性骨折和肌肉无力。在 Suo 等人最近的一项研究中，28 Zmpste24 缺乏加速了软骨衰老和退化。其他研究29也提示Lamin A和核稳定性在机械通气过程中肺泡细胞的机械感受中起重要作用。然而，Zmpste24表达和核膜稳定性的降低是否与软骨细胞的机械超负荷有关仍不清楚。
更好地了解软骨生物学中机械应力和软骨衰老之间相互作用的分子机制将有助于延缓 OA 的发生和进展。在我们的研究中，我们构建了膝内翻 OA 患者和机械不稳定性小鼠模型的有限元分析 (FEA) 模型，以研究以下内容：1. 膝内翻 OA 患者胫骨平台软骨的应力分布。2. OA 患者和小鼠的应力分布与衰老细胞标志物 p21 和 Zmpste24 表达之间的关系。3. 通过体外过表达 Zmpste24 来维持核稳定性是否可以挽救过度机械应力引起的软骨细胞衰老和退化。
结果
对于患有骨关节炎和膝内翻畸形的患者，机械应力集中在胫骨平台的前内侧 (AM) 区域。
胫骨软骨表面分为四个区域：前内侧 (AM)、前外侧 (AL)、后内侧 (PM) 和后外侧 (PL；图 1 F)。主压应力用于表征软骨的压缩状态。半月板和韧带的材料特性如表 1和表2所示。股骨、半月板和胫骨软骨在 AM 中承受的应力水平较高（图 1 G；图 S1 A 和 S1B）。股骨软骨的峰值压缩主应力为 7.96 Mpa，而半月板的峰值压缩主应力为 11.6 Mpa。胫骨软骨的峰值压缩主应力为 4.44 Mpa。如图1所示J中，AM区域压应力最大，压应力大于2 MPa的节点比例超过34%；AL区域压应力大于2 MPa的节点比例为9%；PM区域压应力大于2 MPa的节点比例为0.8%；PL区域压应力大于2 MPa的节点比例为0%。4个区域的平均主压应力分别为AM：-1.42 MPa、AL：-0.88 MPa、PM：-0.51 MPa、PL：-0.26 MPa。
图1 建模与有限元分析流程
用Tresca应力来表征软骨的剪切状态，最大剪切力出现在软骨与骨的接触面上，AM区域的Tresca应力水平最高（图1H；图S1C和S1D）。AM区域剪应力较大，剪应力大于1.6 Mpa的节点丰度超过25.7%，AL区域为9.3%，PM区域为0.1%，PL区域为0%（图1K ）。4个区域平均Tresca剪应力分别为：AM：0.84 Mpa、AL：0.61 Mpa、PM：0.35 Mpa、PL：0.19 Mpa。
接触压力表示接触引起的表面压力。最大接触压力发生在软骨与骨的接触面上。如图1 I、图 S1 E 和 S1F 所示，AM 区域上的接触压力最大，其中接触压力大于 2 MPa 的量超过 22.7%，AL 区域为 0.4%，PM 区域为 0%，PL 区域为 0%（图 1 L）。四个区域的平均接触压力分别为 AM：0.95 Mpa、AL：0.57 Mpa、PM：0.31 Mpa、PL：0.15 Mpa。
将该分析获得的最大主压应力和Tresca剪应力与相同载荷条件下健康膝关节30的计算结果进行了比较，如图1M和1N所示。
胫骨平台前内侧区Zmpste24下调，p21上调，且二者存在线性相关性
如图2 A所示，我们在四个区域（AM、AL、PM 和 PL）的中心各钻孔，然后进行组织学和免疫组织化学染色。所有纳入患者的人口统计数据收集在表 3中。结果显示 AM 区域的软骨磨损最严重，垂直裂隙/侵蚀延伸至 50–75% 的软骨（图 2 B）。大多数标本的 OARSI 评分为 5（图 2: 图 2 C）中，PM区磨损程度相对较轻，OARSI评分大多为2~4分，而AL和PL区几乎没有磨损，评分大多为2分或以下。AM区软骨磨损最严重，与该区域的最大应力相一致。IHC结果显示，AM区p21表达最高（图 2B、2D），其余三组间表达量差异均无统计学意义，AM区Zmpste24表达低于其余三组（图 2结论：软骨应力作用下p21表达量明显高于正常对照组（P<0.01），其余三组间差异均无统计学意义（P>0.05）（图2B和2E），其余三组间差异均无统计学意义。对Zmpste24与p21表达量进行线性回归分析，结果显示，二者呈负相关，r2为0.4106，回归方程为Y=−0.5176X+104.7（图2F）。综上所述，软骨应力的大小与p21表达量成正比，与Zmpste24表达量成反比，软骨受到过大的应力导致软骨细胞衰老，因此Zmpste24可能参与了这一过程。
图2 内翻性全膝关节置换术患者胫骨软骨不同部位p21和Zmpste24的表达及相互关系
表 3本研究中使用软骨样本的患者的人口统计数据
在接受内侧半月板不稳定治疗的小鼠的内侧平台软骨中，Zmpste24 表达下调，而 p21 表达上调
由于正常个体胫骨平台软骨难以获取, 难以与膝内翻患者软骨进行比较, 因此我们建立了内侧半月板不稳定小鼠模型, 并改变了其下肢的力线。前期研究31报道DMM 模型会增加胫骨内侧软骨的应力。因此我们对Sham 组和DMM 组小鼠的软骨下骨进行了重建分析, 发现DMM 组小鼠软骨下骨重建明显, 软骨下骨硬化程度明显, 可能进一步加剧软骨机械传导异常(图3 A、3B)。HE 和番红花O/固绿染色显示, 大多数磨损发生在内侧软骨(图3C、3D）。IF染色分析显示，DMM组小鼠胫骨内侧软骨中Col2a1和Zmpste24表达降低，p21表达升高，与患者标本的结果一致（图3E、3F）。此外，对软骨中Zmpste24与p21表达水平进行线性回归分析，结果显示二者呈负相关，r2为0.6178，回归方程为Y=−0.7613X+76.15（图3G）
图 3 DMM 手术小鼠胫骨软骨中 Zmpste24 表达下调
在细胞拉伸模型中观察到 Zmpste24 下调和核不稳定性
人和小鼠膝关节软骨所处环境复杂，因此我们分别以5%伸长率模拟生理条件下的应力和20%伸长率模拟病理条件下的机械超负荷，对软骨细胞进行拉伸刺激。研究结果显示，在5%拉伸力下，Sox9和col2a1的表达水平在拉伸12或24小时后增加，而衰老相关基因如p21、p16 INK4a和p53，基质分解相关基因如Mmp13以及肥大性纤维化标志物Col10a1和Col1a1的表达降低（图4 A和S2 A和S2B）。同时，Zmpste24的表达没有显著变化（图4C和4F）。20%张力下，不同加载时间后Sox9和Col2a1表达量降低，p21、p16 INK4a、p53、Mmp13、Col10a1、Col1a1表达量增加（图4 B及S2 A和S2B）。20%张力下，β-半乳糖苷酶阳性细胞数量增加，而Zmpste24表达量降低（图4 C、4E和4F）。因此，20%张力对软骨细胞有负面影响，Zmpste24可能参与了这一过程。同时我们发现，20%张力下，细胞骨架发生重排，核泡状比例大大增加（图4 C和4D），表明机械超载下核膜是不稳定的。
图 4 过度周期性拉伸诱导软骨细胞中 Zmpste24 表达下调、核膜不稳定和细胞衰老
Zmpste24 过表达挽救了机械超载引起的核不稳定性、软骨细胞退化和衰老
在本研究中，我们构建了一个稳定过表达 Zmpste24 的细胞系，并使其受到 20% 的拉伸应力。qRT-PCR 和 IF 结果显示过表达成功（图 5 A 和 5E）。过表达 Zmpste24 后，机械超负荷引起的软骨退化和衰老得到显著挽救，如 qRT-PCR 和蛋白质印迹所示（图 5 B-5D）。核膜的 IF 染色也表明，过表达 Zmpste24 导致核膜更稳定，对过度机械负荷的耐受性更强，因为在机械超负荷后出现核泡的细胞更少（图 5 E-5G）。此外，过度机械应力产生的 ROS 被 Zmpste24 过表达清除（图 5E和 5H)。
图 5 Zmpste24 的过表达可以挽救 体外机械超负荷引起的软骨细胞退化和衰老
图6 Zmpste24和核膜稳定性在异常力学条件下软骨退变衰老中的作用
讨论
机械负荷和衰老被视为骨关节炎病因的重要因素。根据我们的研究结果，我们证实了内翻患者胫骨平台前内侧区域存在异常机械应力。Zmpste24 下调在机械负荷引起的软骨细胞衰老中起着重要作用。此外，体外实验初步证明了 Zmpste24 过表达在预防早期机械负荷诱发的骨关节炎方面具有潜在的治疗作用，但不久的将来应开展进一步的体内实验。
FEA 是一种广泛使用的力学分析方法，其利用图像数据和力学参数（例如各种组织成分的弹性模量）构建各种结构的 3D 模型，进一步用于计算各种组织结构在不同病理条件和手术干预下所经受的机械应力。31、32需进行置换手术的膝内翻性OA患者，其胫骨平台内侧软骨及半月板磨损较为严重，各类组织的分割重建较为困难。为明确膝内翻性OA患者胫骨平台各区域应力分布情况及其与软骨Zmpste24及衰老标志物p21表达的关系，由经验丰富的外科医生与工程师协作，对膝关节韧带、半月板等软组织进行分割，成功重建术前膝关节3D模型，并进行后续分析。
本研究将患者胫骨平台分为四个不同区域，通过FEA和IHC分析发现，前内侧区域的剪切力、压缩应力和接触应力变化最为显著，与Zmpste24表达的减少和p21表达的增加相一致。在患者软骨标本中观察到Zmpste24与胫骨平台软骨应力分布和衰老之间存在相关性。
核膜起泡是细胞衰老和核膜不稳定的特征。33核膜不稳定会进一步导致异染色质分布、组蛋白表观遗传状态的变化以及对 DNA 损伤的敏感性。28 , 34 , 35 , 36 Mu 等人33证实Zmpste24能够与细胞骨架共同调控核膜的刚度和干细胞的衰老。本研究结果还证实，在机械超负荷环境下，软骨细胞F-actin多发生垂直于应力方向的重排，在20%拉伸应力下出现明显的核泡形成，而Zmpste24过表达可显著提高核膜的稳定性，增强软骨细胞对异常力学环境的抵抗力。Alonso等29发现抑制Zmpste24功能，降低核硬度，使肺泡细胞对机械通气引起的高压具有更强的抵抗力。这与我们的研究结果相矛盾，我们的研究结果表明，不同的压力类型和功能器官所需的最合适的核膜硬度是不同的，在不同的机械环境下需要强化或软化核膜，以避免过度负荷对细胞产生负面影响。大量研究探讨了Zmpste24表达降低导致细胞衰老的机制，如表观遗传调控、28氧化应激、37植物保护38和炎症39 。在我们的研究中，我们发现机械超载和随后的 Zmpste24 下调会产生过量的 ROS，而 Zmpste24 的过表达可以有效清除它，这意味着抗氧化应激可能是 Zmpste24 保护下的潜在机制。
综上所述，本研究通过对患者胫骨软骨的FEA和IHC分析，首次发现Zmpste24表达降低引起的核膜不稳定可能参与了不同力学条件下软骨细胞衰老的过程。此外，我们还在体外探索了Zmpste24过表达和核稳定在力学相关衰老中的保护作用。未来，我们将探索除基因编辑疗法之外的其他方法来稳定核膜，从而为力学异常相关疾病提供更多的治疗选择。
研究的局限性
本研究存在一定的局限性。首先，我们仅探讨了 Zmpste24 与内翻和内侧半月板失稳患者机械诱导衰老的关系。因此，应该对外翻 OA 患者的软骨标本进行类似的研究。其次，我们仅在体外观察了 Zmpste24 过表达的保护作用。在后续研究中，我们将把过表达 Zmpste24 的腺相关病毒 (AAV) 注射到小鼠膝关节内，进一步验证 Zmpste24 过表达的有效性。最后，我们仅集中研究了 p21 和 Zmpste24 在胫骨平台的表达，而不是股骨软骨和半月板的表达，因为从 TKA 手术中很难获得完整的股骨软骨。
STAR★方法
